山西地方豬種肉質相關基因相對表達量比較分析

孟冬霞，馬政禹，曹日亮

（1.山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西 太原 030032；2.山西農業大學，山西 晉中 030801）

肉質是一個綜合經濟性狀，受遺傳、生理、營養、飼養管理條件等諸多因素的影響，其中豬品種的遺傳特性對豬肉品質起決定性作用[1]。多年的研究結果表明，肉的化學組成、生理變化和食用品質等均受到基因表達的調控，基因對肉品質的影響主要表現在以下幾個方面：肉色、最終pH、持水性、肌內脂肪。己糖激酶同工酶（HK）基因、ATP合成酶（ATP5B）基因及磷酸果糖激酶（PFK）基因與pH、肉色、滴水損失有關，心臟脂肪酸結合蛋白（H-FABP）主要影響肌內脂肪含量，MyoD基因族和鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST）主要調控肌纖維的生長和轉化，脂蛋白脂肪酶（LPL）基因主要影響脂肪代謝、沉積，與背肌長、平均背膘厚顯著相關[2-4]。山西黑豬、晉陽白豬是山西主要2個地方豬種。本項目在對山西黑豬和晉陽白豬肉色、pH、系水力、肌內脂肪含量、氨基酸含量、脂肪酸含量、膽固醇含量等肉質特性分析的基礎上，進一步對 CAST、H-FABP、ATP5B、LPL、MyoG、PFK、HK等7個肉質相關基因表達量進行比較分析，為系統開展山西地方豬種肉質性狀遺傳控制奠定基礎，同時也為山西地方豬種的推廣應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

2016年6—9月在山西大同地區某豬場進行飼養試驗，在大同生豬定點屠宰場進行屠宰，屠宰時迅速取背最長肌組織樣品，裝入凍存管，編號并及時投入液氮中迅速冷凍，然后將所有樣品轉到-70℃低溫冰箱中保存。

1.2 試驗動物與分組

選擇體重30 kg左右的山西黑豬、晉陽白豬各30頭，按品種分為2組，即山西黑豬組和晉陽白豬組，每組5個重復，每個重復6頭豬，組間平均體重差異不顯著。預試期10 d，進行驅蟲和健胃后，開始正式試驗。飼喂相同飼糧，豬瘟、口蹄疫、藍耳病等免疫程序按常規進行。體重達110 kg左右時，飼養試驗結束。

1.3 測定指標

飼養試驗結束后，進行屠宰，每個品種隨機抽選6頭豬進行屠宰取樣，測定CAST、H-FABP、ATP5B、LPL、MyoG、PFK、HK 等 7個肉質相關基因，并進行比較分析。

1.4 主要試劑、儀器

Trizol試劑盒、cDNA合成試劑盒、核酸染色劑、瓊脂糖，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；SW-CJ-1D潔凈工作臺，江蘇蘇潔凈設備廠生產；HC－2518R高速冷凍離心機，安徽中科中佳儀器有限公司生產；H6－1微型電泳槽，上海精益有機玻璃制品儀器廠生產；FR980凝膠成像系統，上海復日科技有限公司生產；PCR反應擴增儀，BIO公司生產；TU－1901紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司生產；移液器（100～1 000 μL，20～200 μL，0.5～10 μL），加拿大 BBI公司生產；LightCycler480 Software Setup，Roche羅氏生產。

1.5 功能基因檢測方法

1.5.1 總RNA提取、cDNA合成 應用Trizol試劑盒提取試驗豬背最長肌總RNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和核酸儀檢測驗證RNA的完整性。注意：整個操作要戴口罩及一次性干凈手套，并盡可能在低溫下操作；使用cDNA合成試劑盒合成cDNA。

1.5.2 引物設計 應用Primer Premier 5.0軟件，針對7個目的基因進行引物設計，引物序列和擴增片段信息見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列和擴增片段信息

1.5.3 PCR擴增 將cDNA樣品稀釋8倍作為模板進行實時熒光定量PCR檢測。PCR反應體系20 μL：SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。PCR 反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性7 s，57℃退火10 s，72℃延伸15 s，共45個循環。完成上述步驟后，把加好樣品的96/384孔細胞培養板放在LightCycler480 Software Setup（Roche羅氏）中進行反應。

1.5.4 豬肉樣品中功能基因相對表達量的檢測CAST、H-FABP、ATP5B、LPL、MyoG、PFK、HK 等 7 個基因相對表達量的檢測均是由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.6 數據的統計分析

基因相對表達量用2－△△Ct法計算。數據采用SPSS 18.0中的ANOVA程序進行方差分析和鄧肯氏（Duncan）多重比較。試驗結果以均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 豬肉樣品中RNA檢驗結果

從豬背最長肌組織樣品中提取RNA，總RNA提取濃度在 200～1 000 ng/μL，OD260/OD280比值在1.8～2.0之間，表明總RNA純度良好，可以滿足試驗要求。2個品種的豬肉樣品均擴增出特異性條帶。

2.2 豬肉樣品7個基因相對表達量測定結果

豬肉樣品7個基因相對表達量的測定結果見表2。由表2可知，山西黑豬HK、MyoG基因的相對表達量極顯著高于晉陽白豬（P<0.01）；山西黑豬HFABP、CAST基因的相對表達量均顯著高于晉陽白豬（P<0.05）；山西黑豬 ATP5B、PFK、LPL基因的相對表達量均高于晉陽白豬，但差異不顯著（P>0.05）。

表2 豬肉樣品7個基因相對表達量測定結果

3 討論

豬心型脂肪酸結合蛋白（H-FABP）基因是近年發現的影響豬肉質的主要候選基因[5]，主要在心肌和骨骼肌細胞中表達，對長鏈脂肪酸穩定的吸收和代謝有關鍵作用[6-7]。H-FABP基因的多態性顯著影響IMF（肌內脂肪）含量和背膘厚[8]。IMF是嫩度的一個主要決定因素。Patrica等研究發現，肉的嫩度隨IMF的含量增加而改善，是因為肌纖維內部和肌束之間的脂肪組織和結締組織呈交叉狀分布，脂肪含量增多可能會降低結締組織的物理強度，最終使肉的嫩度得到改善。CAST活性與肉的嫩度具有高相關性，與肌肉剪切力的平均表達高達28.9%，可作為肉質嫩度性狀的候選基因[9]。本試驗中山西黑豬H-FABP、CAST基因的相對表達量均顯著高于晉陽白豬（P<0.05），與文獻[10]中山西黑豬的肌內脂肪含量顯著高于晉陽白豬試驗結果一致。

肌纖維是構成肌肉的基本單位，肌纖維直徑越細，肉質越嫩；肌纖維比例越大，肉質也越細嫩。肌纖維的生長和轉化受到MyoD基因族和鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST）的調控[3，11-12]。MyoD 基因家族包括Myf-3、肌細胞生成素 Myf-4（MyoG）、Myf-5 及人體Myf-6基因。MyoG主要在骨骼肌中表達，是骨骼肌生長發育的抑制因子，與豬的生長性能和胴體特性相關，MyoG的突變能改變肌肉肌纖維的數目。脂蛋白脂肪酶（LPL）是動物機體組織脂肪沉積過程中的關鍵酶，能夠把血液中極低密度脂蛋白所攜帶的甘油三酯和乳糜微粒分解成甘油和脂肪酸，為脂肪組織合成甘油三酯提供的原料。王剛等對萊蕪豬和魯萊豬的研究表明LPL是肌內脂肪沉積的重要參與者，其編碼基因的表達具有明顯的體重發育特征，并對肌內脂肪的沉積具有一定程度影響[13]；本試驗中山西黑豬MyoG基因表達量極顯著高于晉陽白豬（P<0.01），山西黑豬LPL基因的表達量與晉陽白豬差異不顯著（P>0.05）。文獻[10]中由于經費原因，沒有測量山西黑豬和晉陽白豬的肌纖維直徑、背肌長及平均背膘厚，條件允許時將進一步進行檢測分析。

ATP合成酶基因與動物的能量代謝、骨骼肌的形成、肌內脂肪含量都有著密切關系[14]，通過對肌肉中糖代謝的調節，ATP5B基因在最終肉質性狀（pH、肉色、滴水損失）中起著關鍵控制作用[15]；HK基因是糖酵解途徑的第一個酶，也是糖酵解途徑的限速酶，對宰后豬肉品質形成具有重要影響[16]。生豬屠宰后，肌肉pH從7.0降至5.5左右，肌肉首先變硬變粗，隨后變嫩，經過一系列變化過程，最終形成具有一定色澤、質地、風味等品質特性的食用肉。研究表明，不同品種豬宰后其肉品質具有一定差異性，且宰后無氧糖酵解速度和程度對肉品質形成具有重要影響，無氧糖酵解速度越快，越易產生PSE肉[17]。ATP5B、PFK和HK基因均與pH、肉色、滴水損失有關。由試驗可知，山西黑豬HK基因的相對表達量極顯著高于晉陽白豬，山西黑豬ATP5B、PFK基因的相對表達量與晉陽白豬差異不顯著（P>0.05），與文獻[10]中 pH、L 值（亮度）、b值（黃度）、系水力試驗結果基本一致。