CTAB反膠束體系合成己酸乙酯及氣相色譜法檢測

（威海海洋職業學院，山東 威海 264300）

己酸乙酯作為濃香型白酒的主要風味物質，廣泛應用于釀酒行業[1].目前一般采用對甲苯磺酸或硫酸等化學法合成己酸乙酯[2].但化學法會產生很多缺點，比如有毒物質殘留、副反應多、后處理復雜、白酒質量差等.而生物合成法合成短鏈酯已成為研究熱點[3-6].生物合成法有兩種：一種是微生物合成法，即利用反應液中微生物細胞內的酶進行催化合成，其缺點是操作繁瑣、代謝產物復雜、產量小，無法滿足企業實際生產的需要；另一種是酶合成法，優點是酶因不溶于有機溶劑可反復使用、酶催化反應條件溫和、副產物少.近年來，利用酶合成己酸乙酯迅速發展.1991年荷蘭某公司就推出了生物酯產品，批次生產規模相當可觀[7].國內關于脂肪酶催化合成酯也有相關報道，例如張艷等人用脂肪酶在非水相中催化合成己酸乙酯，最終用滴定法通過測定正己酸消耗量計算產物的產率達90%以上[8].脂肪酶催化合成己酸乙酯多使用有機介質，如正己烷或正庚烷溶劑[9]，酶催化己酸和無水乙醇合成己酸乙酯的無溶劑體系，產品后期處理更簡單，環境污染較小，但因為反應體系的極性較高，易造成酶蛋白變性而降低催化活性.[1]近年來，反膠束酶催化反應成為新的研究熱點，反膠束是一種微乳液，其表面活性劑分子組成的膜將油水相隔開，模擬酶的天然環境，從而有利于保持酶的活性和穩定性[10].因此利用反膠束酶催化合成己酸乙酯的方法簡便、快捷、高效，會給企業帶來新的發展.

己酸乙酯作為一些白酒的重要特征指標，它含量的高低在某種程度上標志著酒質量的好壞[11].目前檢測己酸乙酯的方法主要是酸堿滴定法測定轉化率.酸堿滴定法檢測誤差太大，步驟繁冗，檢測速度慢，且反膠束體系環境復雜，不利于檢測；同時，由于己酸為弱酸，盡管使用濃度極低的標準氫氧化鈉滴定，分析樣品中己酸含量很少且相差不明顯，導致滴定分析數據穩定性不好[12].而氣相色譜檢測法分離效率高，樣品用量少，檢測靈敏度高，選擇性好，可分離、分析恒沸混合物，沸點相近的物質.試驗以陽離子表面活性劑CTAB構建反膠束體系催化合成己酸乙酯，建立氣相色譜外標法檢測己酸乙酯的產量，為實際生產中己酸乙酯的檢測提供依據.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脂肪酶；己酸乙酯（色譜純）；正己酸（分析純）；三氯甲烷（分析純）；正丁醇（分析純）；異辛烷（分析純）；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，分析純）；正己醇（化學純）；聚乙烯醇；磷酸（分析純）；橄欖油（化學純）；考馬斯亮蘭G250（分析純）；無水乙醇、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）等均為分析純.

1.2 儀器與設備

SP6800 A氣相色譜儀（山東省南瑞虹化工儀器有限公司），CHA-S恒溫振蕩器（金壇市新航儀器廠），78-1型磁力攪拌器（江蘇常州國華儀器廠），DS-1高速組織搗碎機（上海標本模型廠），98-1-B型電子調溫電熱套（天津泰斯特儀器有限公司），DHP-9002型電熱恒溫培養箱（上海益恒實驗儀器有限公司），HH-8恒溫水浴鍋（金壇市新航儀器廠），TGL-16G臺式高速離心機（上海安亭飛鴿有限公司）.

1.3 試驗方法

1.3.1 脂肪酶CTAB反膠束體系的制備

以異辛烷：正己醇：酶溶液（體積比）為43∶6∶1配制反膠束體系，加入100 mmol/L的CTAB，用磁力攪拌器充分攪拌混合，形成透明均一的澄清體系.

1.3.2 CTAB反膠束體系中脂肪酶催化反應單因素反應及正交試驗

反應條件：向上述反膠束體系中先加入己酸，再加入乙醇，置于恒溫振蕩器上，反應溫度35℃，反應時間為24 h，搖床轉速選為150 r/min[13].

單因素及正交試驗：首先進行反應溫度、乙醇和己酸的物質的量比、酶濃度、己酸濃度的單因素試驗，然后進行四因素三水平正交試驗.反應結束測定己酸的轉化率，并得出最佳試驗條件.

1.3.3 己酸轉化率的測定：NaOH滴定法.

移取1 mL反應液于50 mL錐形瓶中，加入10 mL 95%的酒精終止反應，再滴加兩滴酚酞指示劑，用NaOH溶液滴定至微紅色，15 s不褪色為止，記下消耗的NaOH溶液體積V0.同時，取未反應的混合液進行空白試驗，測得消耗的NaOH溶液體積V.

1.3.4 氣相色譜檢測方法的建立

1.3.4.1 氣相色譜分析條件

SE-30毛細管柱（15m×0.25mm，0.25 μm）；檢測器（采用GC-2010FID氫焰檢測器）溫度，180℃；汽化室溫度，140℃；柱溫，120℃；載氣，氮氣（純度99.99%）；分流比：不分流.

1.3.4.2 定量、定性方法

峰面積外標法定量，出峰時間定性[14].

1.3.4.3 標準曲線的繪制及線性范圍的確定[15]

對己酸乙酯色譜純標樣進樣，進樣量分別為0.1～1.0 μL.以峰面積為橫坐標，己酸乙酯標樣含量為縱坐標，繪制標準曲線.以峰面積（Y）為響應值，與己酸乙酯標樣含量（X）進行回歸，得到標準曲線回歸方程[16].將供試品峰面積帶入回歸方程，計算己酸乙酯產物含量.

1.3.4.4 氣相色譜檢測方法的驗證

精密度試驗：用己酸乙酯色譜純標樣進樣0.2 μL，連續進樣8次[17].根據峰面積計算相對標準偏差.

回收率試驗：用己酸乙酯色譜純分別進樣五組0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μL，每組進樣3次做平行試驗.以己酸乙酯標樣理論值為參比值，計算回收率.

1.3.5 氣相色譜檢測

將已處理的轉化液進樣0.5 μL，再進樣己酸乙酯標樣（0.5 μL）和轉化液（0.5 μL）的混合物，根據二者峰的變化定性確定轉化液中己酸乙酯的峰的位置，通過標準曲線，已知峰面積，確定產物含量.

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 溫度對己酸轉化率的影響

添加質量濃度為0.003 g/L的脂肪酶，己酸濃度為0.3 mol/L，己酸和乙醇的物質的量比為1∶1，研究脂肪酶在不同溫度條件下，搖床轉速為150 r/min條件下24 h時反應.結果見圖1.

由圖1可知，隨著溫度升高，己酸乙酯的轉化率先增加后下降，當溫度為35℃時，轉化率最高，可見，脂肪酶在此溫度下活性最高，最有利于其催化反應，超過該溫度，酶的活性下降，反應速度下降，產物產量下降.因此單因素溫度結果為35℃.

2.1.2 己酸濃度對己酸轉化率的影響

添加質量濃度0.003 g/L的脂肪酶，己酸和乙醇的物質的量比為1∶1，研究脂肪酶在不同己酸濃度，搖床轉速為150 r/min條件下，35℃，24 h時反應.結果見圖2.

圖1 溫度對己酸乙酯轉化率的影響

圖2 己酸濃度對己酸轉化率的影響

由圖2可知，隨著己酸濃度增加，己酸轉化率先增加后降低，當己酸濃度為0.4 mol/L時，己酸轉化率達到最高.分析可能的原因是，當己酸濃度較低時，隨著濃度增加，反應速度增加，產物產量增加，當己酸濃度繼續增加后，可能是由于濃度高抑制了脂肪酶的活性，導致反應速度降低，因而產物產量降低，即己酸轉化率降低.因此單因素己酸濃度選擇0.4 mol/L.

2.1.3 醇酸比對己酸轉化率的影響

添加0.003 g/L的脂肪酶，己酸濃度為0.4 mol/L，研究脂肪酶在不同醇酸比（0.8∶1，0.9∶1，1∶1，1.1∶1，1.2∶1），搖床轉速為150 r/min條件下，35℃，24 h時反應.結果見圖3.

隨著醇酸比的增加，己酸轉化率呈現先升高后降低趨勢.分析可知，反應初始由于乙醇濃度較低，體系中反應速度慢，因此己酸轉化率較低，隨著乙醇濃度的增加，反應速度加快，己酸轉化率升高；當乙醇濃度繼續增加，乙醇濃度過高，剩余的乙醇抑制反應，導致體系中反應速度減緩，因而己酸轉化率隨之降低.

2.1.4 酶濃度對己酸轉化率的影響

醇酸比為1∶1.1，己酸濃度為0.4 mol/L，研究脂肪酶在不同濃度下，搖床轉速為150 r/min條件下，35℃，24 h時反應.結果見圖4.

圖3 醇酸物質的量比對己酸轉化率的影響

圖4 酶濃度對己酸轉化率的影響

由圖4可知，隨著酶濃度的增加，己酸轉化率先增加后降低，在酶質量濃度為0.003 g/L時之前，反應速度增加，是由于反應底物充足，隨著酶濃度增加，反應速度也增加，產物產量增加.隨后，反應速度緩慢，分析可能由于酶相當于底物是充足的，反應速度降低.因此單因素酶質量濃度選擇0.003 g/L.

2.2 正交試驗優化結果

選取四因素三水平的正交試驗表，確定每個因素的水平.然后按照正交試驗表進行正交試驗，每個條件做兩個平行.反應結束后取樣，終止反應測定己酸轉化率.正交試驗條件和結果如表1和表2所示.

表1 正交試驗因素水平表

表2 L9（34）正交試驗結果

用SPSS軟件處理正交試驗的結果，處理結果如表3所示.

表3 正交試驗方差分析表

由正交試驗結果可知，4個變量對己酸乙酯的轉化率都有影響，分析表2可得，影響因素排序：B＞A＞C＞D，即酸濃度＞溫度＞醇酸比＞酶濃度，分析表3可知，最佳反應條件為：A2B1C1D2，即反應溫度為35℃，醇酸比為1∶1，酸濃度為0.03 mol/L，酶質量濃度為0.003 g/L.

按照反應的最佳條件，測定隨著時間變化，己酸轉化率變化，如圖5所示.

圖5 己酸轉化率圖

隨著反應時間增加，己酸的轉化率呈增大趨勢，當在第16 h，己酸的轉化率達到最大，之后處于穩定狀態.因此本條件能夠在短時間內使己酸達到較高的轉化率.

陳利梅等[18]研究了反膠束中黑曲霉脂肪酶催化合成己酸乙酯，并得出最優條件和時間曲線.結果發現，隨著反應時間的延長，反應轉化率逐漸增加.但是隨后略有降低.與本實驗相似，可能是由于隨著時間延長，酶的活力降低造成的.

2.3 己酸乙酯色譜峰的確定

試驗選取己酸乙酯色譜純進樣，得出己酸乙酯色譜峰的位置，如圖6所示，2～3 min之間的峰1即為己酸乙酯.

圖6 氣相色譜檢測己酸乙酯標樣譜圖

2.4 標準曲線和線性范圍的確定[19]

對系列濃度為0.1～1.0 μL的己酸乙酯標準溶液進行分析，以峰面積為橫坐標，己酸乙酯標樣含量為縱坐標，繪制標準曲線及其線性方程、相關系數，見圖7.

試驗表明，R2＝0.990 9，說明在0.1～1.0 μL范圍內呈良好的線性關系，該標準曲線可以用于定量分析.

圖7 氣相色譜檢測己酸乙酯標樣標準曲線

2.5 精密度試驗[20]

試驗選取己酸乙酯標樣0.2 μL，在本試驗選定的條件下，進行8次平行測定.精密度試驗結果如表4所示，相對標準偏差2.98%.

結果表明該方法具有較好的重現性，是穩定可靠的，能滿足檢測要求.

表4 方法精密度試驗結果 （n＝8）

用己酸乙酯色譜純分別進樣五組0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μL，每組進樣3次做平行試驗.測定結果如表5所示.

經計算平均值和相對標準偏差，得出該方法回收率在87.47%～95.76%，能滿足試驗對準確性的要求.并且隨著標準品進樣量的增加，方法回收率會相應減小，可能是由于隨著進樣量的增加，標樣中的雜質相應增加或標樣被污染.

2.7 反應液中己酸乙酯峰定性，定量檢測[22]

試驗檢測產物時，進樣后所得譜圖見圖8.根據己酸乙酯的峰位置，圖8中峰2為己酸乙酯，并由標準曲線和轉化液中己酸乙酯的峰面積求出其含量.

試驗表明，此方法可以較好的定性、定量測定轉化液中的己酸乙酯的含量.

表5 方法回收率試驗結果

圖8 氣相色譜檢測轉化液中的己酸乙酯譜圖

3 結論

本試驗利用豬胰酶對反膠束體系中己酸乙酯進行催化合成，采用正交試驗得出最佳轉化條件為：溫度為35℃，酶質量濃度為0.003 g/L，己酸濃度為0.3 mol/L，醇酸比為1∶1.隨后利用氣相色譜法檢測反膠束中合成的己酸乙酯，并對己酸乙酯標準物質從標準曲線、線性范圍、回收率、精密度等方面進行了分析研究.試驗表明，己酸乙酯標樣含量在0.1～1.0 μL范圍內呈良好線性關系，相關系數為0.990 9，相對標準偏差為2.98%，回收率在87.47%～95.76%范圍之間.結果表明該方法快速、簡便、靈敏，能夠達到檢測要求.試驗結果表明，該方法用于反膠束體系中脂肪酶催化合成己酸乙酯的定性和定量分析，結果比較滿意，能達到轉化液中己酸乙酯的實驗室檢測要求.