生存素對3T3-L1脂肪細胞中載脂蛋白E表達和分泌的影響

陳樹青， 米日阿依·阿里木江， 白寧寧， 楊穎， 馬曉靜

(上海交通大學附屬第六人民醫院內分泌代謝科， 上海 200233)

生存素(Survivin)是凋亡抑制蛋白家族成員，特異且大量表達于胚胎組織及人類腫瘤細胞，在終末分化的細胞中幾乎不表達[1-2]。我們前期研究[3]結果表明高脂飲食可誘導Survivin在內臟脂肪組織脂肪細胞中重新表達，同時細胞研究表明Survivin參與調節3T3-L1脂肪細胞脂質代謝，并且不影響脂肪細胞分化。載脂蛋白E(ApoE)是與肥胖密切相關的重要脂質轉運蛋白，廣泛表達于多種組織細胞。血漿內的ApoE主要由肝臟合成，同時它在脂肪組織中也高度表達，并且大量研究證明脂肪產生的內源性ApoE同樣發揮調節脂肪細胞脂質儲存的重要作用[4-7]。但現階段有關脂肪細胞來源的ApoE表達調控方面的研究尚不多見。本研究采用攜帶Survivin載體及對照空載體的慢病毒感染3T3-L1脂肪細胞株，探討Survivin在脂肪細胞中的功能以及對ApoE的調節作用，為改善脂質代謝及肥胖提供一種新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料

小鼠3T3-L1細胞系(ATCC細胞庫)；Survivin過表達慢病毒(上海吉瑪公司)；DMEM高糖培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)；重組人胰島素(美國Lilly公司)；地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、二甲基亞砜(DMSO)為美國Sigma 公司產品； Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；PCR引物(上海生物工程有限公司)；逆轉錄、qRT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；細胞蛋白裂解液(RIPA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、BCA法蛋白定量試劑盒(上海碧云天公司)；APOE抗體(美國Santa公司)；Survivin抗體，抗兔、抗鼠熒光二抗(美國CST公司)； ECL化學發光顯影液(美國Milipore公司)。

1.2 3T3-L1脂肪細胞的培養及誘導分化

將3T3-L1前脂肪細胞均勻接種于12孔板，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液，在37℃、5%CO2的條件下培養。待細胞生長融合后，先以10 μg/mL重組人胰島素、0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松、含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液誘導2 d，再單獨以10 μg/mL胰島素誘導2 d后，換用含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養基，每2 d換1次培養液。誘導分化8～10 d后，3T3-L1脂肪細胞分化率達到90%以上可用于實驗。

1.3 慢病毒感染

3T3-L1前脂肪細胞接種于12孔板，當每孔密度達到30%～40%時, 含小鼠源Survivin表達載體的慢病毒或對照病毒以感染復數(MOI)為20用于感染細胞，感染48 h后進行細胞換液。感染效率由48 h后綠色熒光蛋白陽性細胞的數目決定，并以帶有綠色熒光蛋白的慢病毒作對照。將細胞傳代向白色脂肪細胞方向分化，用于隨后的實驗。通過qRT-PCR和蛋白質印跡檢測Survivin表達。

1.4 3T3-L1脂肪細胞的轉錄組分析

對感染Survivin過表達慢病毒以及對照病毒的3T3-L1前脂肪細胞進行培養，并分化至第8天。使用TruSeq RNA樣品制備試劑盒(美國Illumina公司)，按照提供的指南合成配對末端文庫。在上海伯豪生物技術有限公司進行文庫構建以及高通量測序工作。測序得到的數據序列中除去冗余數據，在上海烈冰信息科技有限公司進行數列分析以及生物信息數據分析。

1.5 qPT-PCR檢測ApoE、Survivin等基因的mRNA表達水平

使用Trizol試劑抽提脂肪細胞mRNA，逆轉錄合成cDNA，10倍稀釋后作為模板，采用qPT-PCR檢測基因mRNA表達。ApoE引物序列：上游5′-CTGACAGGATGCCTAGCCG-3′ ，下游5′-CGCAGGTAATCCCAGAAGC-3′；Survivin引物序列：上游5′-GAGGCTGGCTTCATCCACTG-3′，下游5′-CTTTTTGCTTGTTGTTGGTCTCC-3′； 核糖體蛋白基因(36B4)引物序列：上游5′-AAGCGCGTCCTGGCATTGTCT-3′，下游5′-CCGCAGGGGCAGCAGTGGT-3′； 脂肪酸結合蛋白4(Fabp4)引物序列：上游5′ -AAGGTGAAGAGCATCATAACCCT-3′，下游5′-TCACGCCTTTCATAACACATTCC-3′。以36B4作為內參基因，計算2-ΔΔCt值比較基因相對表達量。

1.6 蛋白質印跡檢測3T3-L1細胞及培養上清液中APOE的蛋白表達

在脂肪細胞分化第8天經換液24 h后收取細胞培養上清液并收取細胞，分別提取蛋白，避免凍融循環，凍存于-80 ℃冰箱。按每泳道加20 μg蛋白或者30 μL細胞培養上清液樣品進行SDS-PAGE，100 V、50 min恒壓濕轉至硝酸纖維素膜(0.2 μm)，室溫封閉1 h，一抗(內參β-肌動蛋白1 ∶1 000，APOE 1 ∶500，Survivin 1 ∶500稀釋)4℃孵育過夜，二抗(1 ∶2 000稀釋)室溫孵育l h并洗脫，經Image Quant凝膠成像系統曝光顯像并拍照。

1.7 定量和統計分析

使用Image J圖像分析軟件測定凝膠電泳條帶的灰度，比較蛋白相對表達量。應用SPSS 19.0軟件進行數據處理，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Survivin過表達對3T3-L1脂肪細胞載脂蛋白家族分泌的影響

慢病毒感染3T3-L1前脂肪細胞進行分化培養至第8天時，qRT-PCR和蛋白質印跡結果顯示，與對照組相比，過表達組3T3-L1脂肪細胞中Survivin的mRNA(t=11.71，P<0.01)及蛋白表達明顯增高，見圖1。同時脂肪分化標志物Fabp4 mRNA相對表達水平在過表達組和對照組間的差異無統計學意義(t=1.064，P>0.05),說明Survivin過表達對3T3-L1脂肪細胞分化沒有影響，見圖2。在細胞分化第8天時進行RNA測序，對RNA轉錄組分析數據庫中載脂蛋白家族30個蛋白進行分析，選取其中較高表達量(基因表達豐度FPKM>1)的10個基因作熱圖，熱圖顯示Survivin過表達能夠在轉錄水平特異性下調3T3-L1脂肪細胞ApoE表達，同時其他載脂蛋白表達沒有發生明顯變化，見圖3。

*：P<0.01，與對照組比較圖1 兩組3T3-L1脂肪細胞Survivin mRNA和蛋白相對表達量

圖2 兩組3T3-L1脂肪細胞脂肪分化標志基因Fabp4 mRNA相對表達量

*：P<0.05，與對照組比較圖3 轉錄組分析數據庫兩組間各載脂蛋白相對表達量

2.2 Survivin對3T3-L1脂肪細胞ApoE mRNA表達水平的影響

qRT-PCR結果顯示，過表達組ApoEmRNA較對照組明顯下調，降低了32%(t=9.676，P<0.01)，見圖4。結果表明Survivin能夠在轉錄水平下調3T3-L1脂肪細胞ApoE的表達。

2.3 Survivin對3T3-L1脂肪細胞APOE蛋白表達的影響

蛋白質印跡結果顯示，在3T3-L1脂肪細胞胞內，過表達組APOE蛋白表達較對照組明顯下調(t=4.183，P<0.05)，見圖5。收集分化至第8天的3T3-L1脂肪細胞培養上清液，檢測到細胞分泌的APOE蛋白同樣明顯下調(t=5.683，P<0.01)，見圖6。結果表明過表達Survivin能夠抑制3T3-L1脂肪細胞中APOE蛋白的表達及分泌。

*：P<0.01，與對照組比較圖4 兩組3T3-L1脂肪細胞ApoE mRNA相對表達量

*：P<0.05，與對照組比較圖5 兩組3T3-L1脂肪細胞胞內APOE蛋白表達

*：P<0.01，與對照組比較圖6 兩組3T3-L1脂肪細胞培養上清液中APOE蛋白表達

3 討論

在營養過剩的條件下，脂肪組織可以通過脂肪細胞肥大及增生進行能量儲存，從而防止脂毒性等代謝異常[8]。近年來脂肪組織被定義為一種代謝活躍的內分泌器官，調節營養代謝的穩態。包括載脂蛋白家族在內的多種脂肪細胞分泌的蛋白，能通過介導一系列的信號轉導通路，廣泛參與機體復雜的代謝平衡網絡的調節[9]。脂肪分泌蛋白的表達失衡會引起機體代謝紊亂等一系列反應，進而在肥胖等多種病理過程中產生影響。ApoE是脂質及脂蛋白轉運系統的主要蛋白質，它是極低密度脂蛋白、殘留脂蛋白和高密度脂蛋白的主要成分，主要參與膳食脂質的代謝及體內平衡，并從循環中去除動脈粥樣硬化相關脂蛋白。我們前期研究表明高脂飲食可誘導Survivin在內臟脂肪重新表達，Survivin參與調節3T3-L1脂肪細胞脂質代謝[3]。為研究Survivin是否對載脂蛋白家族具有調控作用，我們對脂肪細胞過表達Survivin后載脂蛋白的變化做了進一步檢測。

Survivin是癌癥進展中的關鍵因子，目前已經明確Survivin能夠與胱天蛋白酶-3、7、9相互作用，從而抑制腫瘤細胞凋亡[10]。近期有研究發現肥胖情況下Survivin在皮下脂肪組織中表達上調，并降低脂肪組織干細胞對于缺氧和瘦素誘導凋亡的敏感性，是脂肪與腫瘤細胞交流的潛在分子[11]。目前大量研究已證實，在肥胖、缺氧、炎癥的條件下Survivin的表達均明顯上調[3,11-12]。而在飲食誘導的肥胖時，脂肪組織中ApoE的表達降低[13]。肥胖狀態下，脂肪細胞能夠通過氧化應激作用，在轉錄水平及蛋白水平抑制ApoE的表達，并且這種抑制取決于脂肪組織間質血管細胞與脂肪細胞之間的相互作用[14]。鑒于肥胖與體內Survivin和ApoE的調節均有相關性，我們推測機體內Survivin與ApoE的調控機制可能存在聯系。本研究結果證實，Survivin對脂肪細胞ApoE的表達及分泌具有下調作用，同時不影響其他載脂蛋白表達及脂肪細胞的分化，但其中的調節機制尚不完全清楚，脂肪細胞ApoE的表達和分泌的下調是否為Survivin的直接作用，尚需進一步研究。

血漿內ApoE有90%來源于肝臟，盡管僅有小部分來自脂肪細胞合成，ApoE作為低密度脂蛋白受體的配體，參與了肝臟乳糜微粒以及極低密度脂蛋白的清除。Chen等[15]研究結果顯示ApoE基因敲除后的小鼠具有較高的基礎氧化應激，會自發造成高血脂和動脈粥樣硬化。近年來許多研究表明，脂肪細胞合成的ApoE可能存在不同于肝臟來源的ApoE的新功能。ApoE在小鼠脂肪細胞中的表達量與體脂量呈正相關[16]。Huang等[4]研究表明小鼠異體移植的脂肪細胞產生的ApoE有助于獲取循環三酰甘油，進行脂質積累。進一步研究表明[5]，在選擇性敲除小鼠脂肪組織ApoE后，肝臟中ApoE的合成并不受影響，循環ApoE仍保持在正常值，小鼠脂肪脂質積累減少、糖耐量改善。最近研究證明[7]，增加的鐵能抑制人脂肪細胞釋放ApoE，此過程與氧化應激有關，可能對改善胰島素抵抗以及肝損傷存在重要作用。關于Survivin下調ApoE表達對糖脂代謝的影響，我們還需在動物水平上作進一步研究。

綜上所述，本研究結果表明，Survivin過表達能在轉錄和蛋白水平下調脂肪細胞ApoE的表達和分泌，揭示了Survivin在脂肪細胞脂代謝中的重要作用。然而本研究僅在體外進行了3T3-L1脂肪細胞誘導分化，在體內脂肪細胞中Survivin能否調控ApoE的表達尚需進一步研究。