人臍帶間充質干細胞培養上清液對甲狀腺乳頭狀癌細胞誘導人臍靜脈內皮細胞血管形成的影響

丁超， 董利陽， 鄭婷婷， 劉佳夢， 康萍， 張助， 毛朝明

(江蘇大學附屬醫院核醫學科， 江蘇 鎮江 212001)

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是一種源于甲狀腺濾泡上皮細胞的惡性腫瘤，發病率約占所有甲狀腺癌的80%[1]。目前PTC的治療方式主要包括外科手術、甲狀腺激素以及放射性碘，然而PTC患者的復發率仍呈逐年上升趨勢[2]。研究表明，腫瘤內血管的形成與PTC的惡性程度、淋巴結轉移以及復發密切正相關[3],而抑制腫瘤新生血管的形成已成為腫瘤治療的焦點。間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一類具有自我更新和多向分化能力的成體干細胞[4]。有研究指出，神經膠質瘤細胞受骨髓來源的MSCs作用后，其分泌物可以顯著抑制內皮細胞血管的形成[5]，提示MSCs有著抑制腫瘤內血管形成的能力。而目前，MSCs對PTC誘導的血管形成有無影響仍不明確。本研究擬用人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord MSCs, hUCMSCs)培養上清液(hUCMSC-CM)刺激PTC細胞系TPC-1，觀察hUCMSC-CM對TPC-1細胞誘導人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)血管形成能力的影響，旨在為PTC的治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1 材料

hUCMSCs的提取參考本課題組前期報道[6]。TPC-1、HUVEC購自上海生物化學與細胞研究所；hUCMSCs培養基(蘇州賽業公司)；胎牛血清、青霉素、鏈霉素及DMEM培養基(美國Gibco公司)；Matrigel基質膠、抗人CD73 PE、抗人CD90 PE、抗人CD14 PE、抗人CD19 PE(美國BD公司)；RNA抽提試劑TRIzol及逆轉錄試劑(日本TaKaRa公司)；實時定量PCR試劑(北京康潤誠業有限公司)；兔抗人血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；兔抗人β-肌動蛋白抗體(美國CST公司)；ECL發光液、PVDF膜(美國Millipore公司)；人VEGF ELISA試劑盒(美國R&D Systems公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 TPC-1細胞及HUVEC細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基(含100 IU/mL青霉素及100 μg/L鏈霉素)中，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。

1.2.2 hUCMSCs的鑒定 將P3代hUCMSCs(1×106個)置于15 mL離心管中，并分別加入CD90、CD73、CD14、CD19及小鼠抗人IgG(陰性對照)抗體。4 ℃條件下染色15 min，隨后用PBS洗滌2次。將洗滌后的hUCMSCs置于流式管中，并應用流式細胞儀檢測抗體表達，使用FlowJo軟件對結果進行分析。使用hUCMSCs成骨誘導培養基、成脂肪誘導培養基(均購自蘇州賽業公司)分別對 hUCMSCs進行培養，21 d后，分別采用茜素紅染色、油紅O染色觀察其向骨、脂肪分化的能力，具體的操作方法參考蘇州賽業公司的實驗手冊。

1.2.3 hUCMSC-CM的收集 將hUCMSCs(P3-P7代)細胞種植于10 cm培養皿中，當細胞長至密度達到70%左右時，更換無血清培養液繼續培養24 h，然后及時收取培養上清液于15 mL離心管，300×g離心5 min以去除細胞碎片，然后將上清液用0.22 μm濾器過濾，分裝，-80 ℃保存。

1.2.4 hUCMSC-CM刺激TPC-1細胞 計數3×105個TPC-1細胞種于6孔板中，待細胞貼壁后吸出培養液，并分別更換為對照培養液、20% hUCMSC-CM、40% hUCMSC-CM繼續刺激24 h。24 h后，再次更換為無血清培養液繼續培養24 h，分別收集3組TPC-1細胞培養上清液于15 mL離心管中，300×g離心5 min以去除細胞碎片，然后將上清液用0.22 μm濾器過濾，用于后續實驗。

1.2.5 基質膠小管形成實驗 實驗前24 h，將基質膠從-20 ℃冰箱中取出放于4 ℃冰箱充分融化，在96孔板中每孔加入50 μL基質膠，將其置于37 ℃、5% CO2培養箱中靜置2 h，使其凝固。計數5×104個HUVEC細胞分別與步驟“1.2.4”中收集的TPC-1細胞培養上清液100 μL混合成細胞懸液，并加入含有基質膠的96孔板中，每組設置5個復孔，置于37 ℃、5% CO2培養箱中，每隔3 h在顯微鏡下進行觀察，當有明顯血管形成時立即進行拍照。使用Image J圖像分析軟件測量各組形成的小管總長度。并計算血管形成率，血管形成率(%)=實驗組長度/對照組長度×100%。

1.2.6 CCK-8法檢測TPC-1細胞的增殖 將TPC-1細胞接種于96孔板(3×103個/孔)，每組設置5個復孔，分別加入對照培養液、20% hUCMSC-CM、40% hUCMSC-CM，在6 h、24 h、48 h時間點，每孔加入10 μL CCK-8溶液，輕輕混勻，在37 ℃、5% CO2培養箱中孵育2 h，使用酶標儀在450 nm波長處檢測光密度(D)值。

1.2.7 實時定量PCR檢測TPC-1細胞中VEGFmRNA的表達 收集對照培養液、20% hUCMSC-CM、40% hUCMSC-CM處理24 h后的TPC-1細胞，TRIzol法提取總RNA，按逆轉錄試劑說明書操作獲取cDNA。以β-肌動蛋白為內參、cDNA為模板，實時定量PCR定量檢測各組TPC-1細胞中VEGFmRNA表達。PCR驗證引物購自廣州富能基因有限公司(產品貨號VEGF：HQP117835；β-肌動蛋白：HQP016381)。PCR反應體系10 μL：cDNA 4 μL、引物1 μL(終濃度為2 μmol/L)、2×Taq預混反應試劑5 μL。反應程序：50 ℃ 2 min; 95 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min，40個循環。基因表達量以2-ΔΔCt表示，實驗獨立重復3次。

1.2.8 蛋白質印跡檢測TPC-1細胞VEGF的表達 收集對照培養液、20% hUCMSC-CM、40% hUCMSC-CM處理24 h后的TPC-1細胞，加入蛋白裂解液RIPA，充分振蕩混勻后置于冰上，每10 min重復振蕩1次，重復3次。隨后12 000×g離心15 min，取上清液，應用BCA法測定蛋白質濃度。接著加入上清液體積1/4的5×上樣緩沖液，充分混勻后置于金屬浴中95 ℃ 10 min熱變性后分裝至-80 ℃保存備用。取40 μg蛋白加至10%聚丙烯酰胺膠中電泳，并濕轉至PVDF膜上。將PVDF膜取出后用5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，并分別加入兔抗人β-肌動蛋白(1 ∶1 000稀釋)、兔抗人VEGF抗體(1 ∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜3次，每次10 min。隨后加入HPR標記的山羊抗兔二抗(1 ∶2 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次后ECL曝光顯影。

1.2.9 ELISA檢測TPC-1細胞培養上清液中VEGF的含量 取步驟“1.2.4”中TPC-1細胞的培養上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，每孔加入50 μL樣本稀釋液，再加入200 μL標準品或待測樣品，將反應板充分混勻后置37 ℃孵育120 min。用洗滌液將反應板充分洗滌3次，在濾紙上印干。每孔中加入200 μL酶標抗體工作液，將反應板置37 ℃孵育120 min。再次洗板并印干，每孔加入200 μL底物工作液，置37 ℃暗處反應120 min。每孔加入50 μL終止液，30 min內用酶標儀在450 nm處測D值。根據標準品D值繪制標準曲線，計算出待測樣品中VEGF含量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 hUCMSCs鑒定

倒置顯微鏡下觀察可見hUCMSCs(P3代)大小一致，呈長梭形，并以“漩渦狀”排列生長。經成骨或成脂誘導培養液培養3周后，分別用茜素紅和油紅O染色，可見橘紅色鈣化物和紅色脂滴，表明這種梭形細胞有著向成骨和脂肪分化的能力。流式細胞術檢測發現，細胞表面CD73和CD90陽性率大于95%，而CD14和CD19陽性率小于2%。這些結果符合國際細胞治療學會對MSCs的定義，提示hUCMSCs提取成功。見圖1。

2.2 hUCMSC-CM作用后的TPC-1細胞培養上清液抑制HUVEC血管形成

基質膠小管形成實驗結果顯示，與對照組相比，經hUCMSC-CM刺激后的TPC-1細胞培養上清液可顯著抑制HUVEC形成管狀結構(F=83.25，P<0.001)。表明hUCMSC-CM顯著抑制了TPC-1細胞誘導HUVEC血管形成的能力。見圖2。

2.3 hUCMSC-CM抑制TPC-1細胞的增殖

CCK-8法結果顯示，與對照組相比，經hUCMSC-CM刺激后的TPC-1細胞在24 h(F=18.35，P<0.01)和48 h(F=18.58，P<0.01)的增殖能力均顯著降低。見圖3。

2.4 hUCMSC-CM抑制TPC-1細胞中VEGF的表達及分泌

實時熒光定量PCR結果顯示，與對照組相比，經hUCMSC-CM刺激后，TPC-1細胞中VEGFmRNA的轉錄水平顯著下降(F=169.5，P<0.001)。蛋白質印跡實驗結果顯示，hUCMSC-CM可明顯下調TPC-1細胞中VEGF蛋白的表達水平(F=217.5，P<0.001)。ELISA分析結果顯示，hUCMSC-CM處理后，TPC-1細胞培養上清液中VEGF的含量明顯降低(F=21.38，P<0.05)。見圖4。

A：hUCMSCs的形態(100×)；B：hUCMSCs的成骨誘導(100×)；C：hUCMSCs的成脂誘導(100×)；D：hUCMSCs的表面標志

圖1 hUCMSC的鑒定

A：各組血管內皮細胞形成的血管網狀結構(100×)；B：血管形成率圖2 基質膠小管形成實驗檢測HUVEC血管形成能力

圖3 CCK-8法檢測TPC-1細胞的增殖

A：實時熒光定量PCR；B:蛋白質印跡；C：VEGF蛋白相對表達量；D：ELISA圖4 hUCMSC-CM作用后TPC-1細胞中VEGF的表達及分泌的變化

3 討論

MSCs是一種源于發育早期中胚層的具有多種分化潛能和自我更新能力的成體干細胞，可來源于多種組織，包括骨髓、脂肪、臍帶、甲狀腺、月經血等[4]。而在眾多MSCs來源的組織當中，人臍帶容易獲得、不違背倫理且hUCMSCs具有易提取、易體外培養、低免疫原性等優勢，hUCMSCs成為了MSCs領域的研究焦點[7-8]，甚至多個國家已成立hUCMSCs細胞庫用于臨床疾病的防治[9]。本研究選用hUCMSCs為研究對象，通過細胞形態的觀察、成骨成脂分化潛能的測定以及流式標志的檢測，進一步證實hUCMSCs提取的可靠性。

腫瘤內血管的形成是腫瘤得以發生發展的重要保證，是腫瘤營養的主要供給。因此切斷腫瘤營養供給成為腫瘤治療的熱點之一[10]。腫瘤細胞在生長過程中可分泌多種促血管生成的因子(如VEGF)以促進腫瘤新生毛細血管的形成[11]，而抑制腫瘤細胞分泌這些促血管生成因子可有效地抑制腫瘤的進展[12]。基于MSCs有著向腫瘤部位趨化的特性，MSCs與腫瘤的關系成為近些年研究的焦點，而MSCs與腫瘤血管形成的報道也日益增多。Zhu等[13]發現，骨髓來源的MSCs和胃癌細胞混合并接種于裸鼠皮下后，腫瘤生長加速，且MSCs可以顯著促使瘤體內新生血管的形成。然而，Otsu等[14]發現，骨髓來源的MSC和黑色素瘤混合并注入裸鼠皮下后，瘤體生長受抑，且瘤內血管密度降低。此外還有研究指出，神經膠質瘤細胞受骨髓來源的MSCs作用后，其分泌物可以顯著抑制內皮細胞血管的形成[5]。這種MSCs對腫瘤血管生成結果的差異可能與MSCs的來源、腫瘤的類型等不同有關[15]。然而，MSCs對PTC誘導的血管生成有無影響目前尚未見報道。

本研究結果顯示經hUCMSC-CM刺激后的TPC-1細胞培養上清液可顯著抑制HUVEC血管的形成。同時hUCMSC-CM可以顯著抑制TPC-1細胞的增殖。這些結果提示hUCMSC-CM對TPC-1細胞有著直接和間接的抑制效應。而hUCMSC-CM對TPC-1細胞的其他生物學效應(如凋亡、侵襲等)是否有影響以及其是否可在體內抑制PTC的生長尚需進一步探究。

VEGF是腫瘤細胞分泌的血管形成最強烈的刺激因子，在血管發生和形成過程中起著重要的正向調控作用[16]。Lee等[17]發現骨髓來源的MSCs的外泌體可抑制乳腺癌細胞VEGF的表達，而受MSCs作用后的乳腺癌細胞，其培養上清液可顯著抑制HUVEC的血管形成。相似的是，本研究結果顯示hUCMSC-CM可以顯著抑制TPC-1細胞中VEGFmRNA和蛋白的表達，且顯著減少了TPC-1細胞VEGF的分泌。這些結果提示hUCMSCs抑制TPC-1誘導HUVEC血管生成的機制可能源于對TPC-1細胞中VEGF表達的負調控。而hUCMSC-CM調控TPC-1中VEGF表達的潛在機制需要進一步探究。

綜上所述，hUCMSC-CM可顯著抑制TPC-1細胞誘導HUVEC血管形成的能力，這種作用機制可能源于對TPC-1細胞中VEGF表達的抑制。這可能為PTC的干預治療提供新的策略。