白蛋白-生育酚納米粒的構建及其聯合化療-光療抗乳腺癌細胞多藥耐藥

高乾乾， 張娜娜， 王昊冉， 陳怡靜， 劉婷婷， 沈海俊

(江蘇大學醫學院， 江蘇 鎮江 212013)

多藥耐藥是目前腫瘤化療失敗的重要原因，逆轉多藥耐藥是改善腫瘤化療效果的關鍵性問題[1]。納米給藥系統的出現為抗腫瘤多藥耐藥帶來了機遇。利用納米給藥系統將光熱治療、光動力治療、化學治療相聯合，可以顯著提高腫瘤的治療效果，已成為抗腫瘤多藥耐藥的新型且有效的手段[2-5]。目前，金納米粒、硫化銅納米粒、石墨烯納米片等納米材料都具有良好的光熱轉換能力，在腫瘤的光熱治療方面展示了良好的應用潛力[6-8]。但是，這些材料的生物安全性尚未明確，限制了其臨床應用。因而，開發具有良好生物相容性的納米材料，并能夠實現化療和光療的聯合治療策略具有重要的意義。

本研究擬采用4種食品藥品監督管理局批準使用的生物材料：D-α-生育酚琥珀酸酯(D-α-tocopherol succinate，TOS)、人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)、吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)、多柔比星(doxorubicin，DOX)，構建一種負載DOX和ICG的人血清白蛋白-生育酚納米粒(DOX-loaded HSA-ICG-TOS nanoparticles，簡稱DOX-HIT-NPs)。其中，DOX為廣譜抗癌藥，具有良好的化療效果；ICG在近紅外光照下具有光熱治療和光動力治療的能力[9]；TOS是維生素E家族中最有效的抗癌藥物，可以引起乳腺癌、前列腺癌、肺癌等多種癌細胞系的凋亡[10]，并可以增加DOX對乳腺癌耐藥細胞株(MCF-7/ADR)的毒性[11]。因此，DOX-HIT-NPs有望實現化學治療、光熱治療與光動力治療的聯合應用，逆轉腫瘤的多藥耐藥。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

HSA(Sigma公司)；TOS、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購自阿拉丁試劑有限公司；ICG(日本東京化學工業有限公司)；DOX(北京華奉聯博科技有限公司)；Live/Dead細胞染色試劑盒、RPMI 1640培養基、胎牛血清(Thermo Fisher公司)；DCFH-DA探針(ROS測試盒)購自南京建成生物研究所；CCK8試劑盒(日本Dojindo公司)；紅外熱成像儀(德國儀器國際貿易有限公司)；808 nm光纖耦合激光器(西安赫胥爾鐳得激光科技有限公司)。

1.2 DOX-HIT-NPs的制備

首先制備HIT-NPs：稱取5 mg HSA溶于10 mL去離子水中，30 mg TOS溶于1 mL乙醇中， 10 mg ICG 溶于1 mL的DMSO中。向TOS溶液中加入適量的EDC和NHS，反應15 min。將10 mL HSA水溶液置于50 mL的離心管中，攪拌條件下，將100 μL TOS(EDC/NHS)溶液逐滴加入到HSA水溶液中，最后將50 μL的ICG溶液逐滴加入到上述混合溶液中，避光攪拌4 h，14 800 r/min離心20 min收集納米粒，去離子水離心洗滌3次，將獲得的HSA-ICG-TOS nanoparticles(HIT-NPs)分散到10 mL去離子水中，備用。

然后制備DOX-HIT-NPs：取1 mL HIT-NPs溶液置于離心管中，將1 mL DOX溶液(0.062 5 mg/mL)逐滴加入，避光攪拌3 h，離心收集納米粒，去離子水超聲分散、洗滌、離心，將獲得的搭載DOX的HIT-NPs(DOX-HIT-NPs)分散到1 mL去離子水中，4 ℃保存備用。

1.3 DOX-HIT-NPs的表征

取超聲分散后的DOX-HIT-NPs納米粒溶液，加10 μL溶液于銅網上，自然晾干后，用透射電鏡進行觀察；采用粒度電位分析儀檢測DOX-HIT-NPs的粒徑；準備ICG、DOX和DOX-HIT-NPs水溶液，用紫外分光光度計分別進行掃描，波長范圍200～900 nm。

1.4 DOX-HIT-NPs的載藥量和分散性

按照將DOX負載于HIT-NPs的方法，離心后收集上清液，檢測上清液在480 nm處的光密度值。通過參考標準曲線將原始數據轉換為DOX濃度，計算DOX-HIT-NPs的載藥量和包封率。將獲得的DOX-HIT-NPs納米粒分散到水、PBS、DMEM、RPMI-1640培養基中考察其分散性。計算公式如下：負載DOX的量(μg)= 投入DOX的總量-上清液中DOX的量；載藥量 =(負載DOX的量/DOX-HIT-NPs的量)×100%；包封率 =(負載DOX的量/投入DOX的總量)×100%。

1.5 DOX-HIT-NPs的光熱轉換能力

配制不同濃度的DOX-HIT-NPs溶液，用近紅外激光(808 nm，2 W/cm2)照射5 min，每隔30 s用浸入溶液中的熱電偶測量納米顆粒溶液的溫度，并用數顯溫度計進行記錄；近紅外激光照射3 min后，用紅外熱成像儀拍攝照片。

1.6 DOX-HIT-NPs的細胞攝取

將MCF-7/ADR細胞按1×105個/孔接種到6孔板中，細胞貼壁后，用含有游離DOX或DOX-HIT-NPs(DOX濃度為10 μg/mL)的新鮮培養基處理細胞。隨后，用PBS小心洗滌細胞3次，并用4%(w/v)多聚甲醛固定15 min，棄去多聚甲醛，用PBS小心洗滌細胞3次；然后用DAPI對細胞核染色5～10 min，用PBS小心洗滌細胞3次，封片準備觀察，最后使用激光共聚焦顯微鏡觀察DOX的細胞攝取。

1.7 DOX-HIT-NPs的細胞毒性

首先，通過測定近紅外光照后活性氧的水平評價DOX-HIT-NPs光動力治療的可能性。將2×104/孔MCF-7/ADR細胞接種到24孔板中，當細胞完全貼壁后，將細胞分別暴露于完全培養基(對照組)、對照+光照、游離DOX、DOX-HIT-NPs、DOX-HIT-NPs+光照(DOX濃度為10 μg/mL)。激光照射采用808 nm，2 W/cm2，5 min。培養24 h后，除去培養基，PBS洗滌3次，然后加入用PBS稀釋1 000倍的DCFH-DA探針，反應20 min左右，用PBS洗滌，熒光顯微鏡觀察。

然后，考察DOX-HIT-NPs的體外化療-熱療-光動力治療的聯合治療效果。將MCF-7/ADR細胞分別接種在96孔板中(5×103個/孔)，并在細胞培養箱中孵育過夜，當細胞完全貼壁后，按照下列組別進行處理：完全培養基(對照組)、對照+光照組、游離DOX組、DOX-HIT-NPs組、DOX-HIT-NPs+光照組(DOX濃度為10 μg/mL)，處理后將細胞繼續培養22 h，CCK8法測定細胞活力；另外，用24孔板同法培養與處理細胞，Live/Dead染色試劑盒進行定性分析，熒光顯微鏡觀察染色后的活細胞(綠色)和死細胞(紅色)。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 DOX-HIT-NPs的制備和表征

透射電鏡觀察DOX-HIT-NPs的形態(圖1A)顯示，DOX-HIT-NPs是近似球形的納米粒。DOX-HIT-NPs的粒徑分布圖顯示(圖1B)，DOX-HIT-NPs呈正態分布，平均粒徑為278.8 nm，粒徑結果比透射電鏡顯示的顆粒稍大，可能是由于DOX-HIT-NPs表面的蛋白水化層導致的。

HIT-NPs用去離子水離心、洗滌3次后，將獲得的納米顆粒重新分散到水中，呈現明顯的綠色(圖1C)，因為TOS和HSA均為無色，只有ICG為綠色，直觀地表明HIT-NPs中存在ICG。進一步地，紫外分光光譜顯示DOX-HIT-NPs與游離的ICG在780 nm附近都有一個吸收峰，是ICG的特征吸收峰(圖1D)。此結果證明ICG成功地結合到納米顆粒中。與游離ICG相比，HIT-NPs的吸收峰出現了輕微的紅移，這可能是由于ICG與白蛋白復合后分子構象變化所致。同樣的DOX-HIT-NPs在近480 nm處具有DOX的特征吸收峰，與游離DOX的特征峰相一致，該結果證明了DOX成功加載到DOX-HIT-NPs中。

A：DOX-HIT-NPs的透射電鏡照片；B：DOX-HIT-NPs的粒徑分布；C：HIT-NPs分散在水中；D：ICG、DOX和DOX-HIT-NPs的紫外可見吸收光譜

圖1 DOX-HIT-NPs的表征

2.2 DOX-HIT-NPs的載藥量和分散性

根據DOX的標準曲線，測得DOX-HIT-NPs的載藥量為16.0%，包封率為90.1%，表明投入的DOX幾乎全部能搭載到HIT-NPs上，說明納米粒具有良好的載藥能力。如圖2結果所示，獲得的DOX-HIT-NPs可以很容易地分散到水溶液、PBS溶液、DMEM、RPMI 1640培養基中，其良好的分散性有利于納米粒在這些體系中的穩定存在，在開展細胞實驗和動物實驗時不會造成聚集而沉淀。

圖2 DOX-HIT-NPs在水、PBS、DMEM、RPMI 1640中分散性

2.3 DOX-HIT-NPs的光熱轉換能力

通過近紅外激光(808 nm，2 W/cm2)照射來考察DOX-HIT-NPs的光熱轉換能力。如圖3A所示，在相同的近紅外激光照射強度下，H2O溶液上升的溫度可忽略不計，而DOX-HIT-NPs能夠在近紅外激光照射下誘導其分散液的快速升溫。在60 s內，濃度為0.21 mg/mL DOX-HIT-NPs分散液的溫度從室溫25.7 ℃升高到45.1 ℃，隨著光照時間的延長，最高溫度可達到47.9 ℃。當DOX-HIT-NPs濃度為0.35 mg/mL，分散液的最高溫度可達到55.5 ℃。紅外熱成像儀對近紅外光照射3 min后的納米顆粒懸液進行拍照(圖3B)所示，紅外熱成像圖像與溫度曲線相吻合，相同的光照條件下，納米粒的濃度越高，溫度越高。以上實驗結果表明DOX-HIT-NPs具有良好的光熱轉換能力。

A：DOX-HIT-NPs的光熱升溫曲線；B：DOX-HIT-NPs的熱成像圖片圖3 DOX-HIT-NPs的光熱轉換能力

2.4 DOX-HIT-NPs的細胞攝取

運用激光共聚焦顯微鏡考察MCF-7/ADR細胞對DOX-HIT-NPs的攝取，結果見圖4，紅色代表DOX的熒光，藍色代表DAPI的熒光(DAPI主要用于標記細胞核)。圖中游離DOX在MCF-7/ADR細胞中含量較少，細胞核內幾乎沒有(紅色和藍色熒光的無重疊)，表現出DOX耐藥細胞株的典型特點。而DOX-HIT-NPs的細胞攝取明顯高于游離DOX，并且細胞核內的DOX含量亦增高，說明DOX-HIT-NPs可以促進MCF-7/ADR細胞對DOX的攝取，具有一定的逆轉耐藥的作用。

2.5 DOX-HIT-NPs體外光動力治療能力評價

如圖5結果所示，在對照組、對照+光照組和游離DOX組都沒有檢測到綠色熒光，說明單純的光照和DOX不會產生活性氧；MCF-7/ADR細胞在DOX-HIT-NPs處理后可以產生綠色的熒光，說明DOX-HIT-NPs可以產生活性氧，這主要是因為DOX-HIT-NPs中含有TOS，根據文獻報道，TOS可能會影響線粒體復合體Ⅱ的泛醌結合位點，誘導活性氧的快速生成。MCF-7/ADR細胞在DOX-HIT-NPs+光照條件下產生的綠色熒光更強，說明DOX-HIT-NPs在光照后活性氧升高，提示DOX-HIT-NPs在近紅外光照條件下具有光動力治療的能力。

圖4 DOX-HIT-NPs的細胞攝取(×600)

圖5 不同因素處理后MCF-7/ADR細胞中活性氧產生情況(×200)

2.6 DOX-HIT-NPs的體外化療-熱療-光動力治療的聯合治療效果評價

如圖6所示，用單純近紅外激光照射MCF-7/ADR細胞，細胞存活率為98.7%，與對照組相比無統計學意義，說明單純光照對MCF-7/ADR細胞無影響。與游離DOX組的單純化療相比，用DOX-HIT-NPs治療后，MCF-7/ADR細胞的存活率明顯降低，與游離DOX組和DOX-HIT-NPs組相比，用DOX-HIT-NPs加光照治療后，MCF-7/ADR細胞的存活率顯著降低，表明近紅外光照產生的光熱治療和光動力治療顯著殺傷了MCF-7/ADR細胞，顯示出協同治療的效果。

為了進一步驗證DOX-HIT-NPs對MCF-7/ADR細胞的聯合治療效果，我們通過Live/Dead染色定性地觀察了不同組別處理后的MCF-7/ADR細胞。結果如圖7所示，與對照組相比，當激光照射后基本上都是綠色信號，說明單純的激光照射對細胞沒什么影響；當用游離DOX培養后，紅色的死細胞數量較少，說明MCF-7/ADR細胞對DOX具有一定的耐藥性；當用DOX-HIT-NPs處理后，與游離DOX組相比，活細胞數量明顯減少，紅色信號的死細胞增多，說明DOX-HIT-NPs可以有效地殺傷MCF-7/ADR細胞；當用DOX-HIT-NPs加光照處理后，死細胞數量明顯增多，綠色信號的活細胞明顯減少，說明在激光照射下DOX-HIT-NPs具有明顯的聯合治療效果。這些結果表明DOX-HIT-NPs可以聯合化療-熱療-光動力治療有效地殺傷耐藥的癌細胞。

*：P<0.05，與DOX組比較；#：P<0.05，與DOX-HIT-NPs組比較圖6 不同處理組對MCF-7/ADR的細胞毒性

圖7 不同處理組MCF-7/ADR細胞的Live/Dead染色圖片(×200)

3 討論

多藥耐藥是腫瘤治療的瓶頸，單一的化療無法滿足當前腫瘤治療的需要。光熱治療法是將光熱轉換材料注射入體內，靶向聚集在腫瘤部位，在近紅外光的照射下將光能轉化為熱能來殺死癌細胞，是一種無創/微創、恢復時間短、無耐藥性的治療方法。將傳統化療與光熱治療聯合可以明顯提高治療效果[3-5]，克服腫瘤的多藥耐藥。光熱治療的關鍵是光敏劑的選擇，無機納米材料具有良好的光熱轉換性能，并且可以作為化療藥物的載體，實現化療與光熱治療的結合，但是在體內的安全性還有待評估[6-8]。本研究以生物相容性優良的HSA、TOS、ICG為原料通過自組裝方式成功制備了HIT-NPs，并負載DOX得到DOX-HIT-NPs。將TOS和ICG逐滴添加到HSA水溶液中，ICG可以吸附到HSA的疏水域上[12]，而TOS一方面通過疏水作用力與HSA結合[13]，另一方面通過TOS的羧基與HSA的氨基反應相互連接。由于TOS的疏水性，在水中會發生聚集而起到“粘合劑”的作用，將與之結合的HSA、與HSA結合的ICG自組裝到一起，在水溶液中形成HIT-NPs[13]。由于DOX和TOS之間可以形成離子配對[14]，可以將DOX負載到HIT-NPs上，形成DOX-HIT-NPs。DOX-HIT-NPs具有良好的分散性。光熱轉換能力結果表明，DOX-HIT-NPs的光熱轉換具有濃度依賴性，即DOX-HIT-NPs濃度越高，光熱效應越明顯，提示可以通過控制DOX-HIT-NPs濃度來調節溫度，在不損傷正常細胞的情況下有效殺傷腫瘤細胞。

根據文獻報道，TOS本身也可以促進多種不同類型的腫瘤細胞的凋亡和壞死[10]。此外，TOS可以增加DOX對MCF-7/ADR細胞的毒性作用[11]，也可以誘導活性氧的生成，促進腫瘤細胞的凋亡和壞死[15-16]。我們的研究結果也證明，包含TOS的DOX-HIT-NPs可以誘導活性氧的產生，有效抑制MCF-7/ADR的生長。而DOX-HIT-NPs在光照條件下，可以明顯增加活性氧的產生，說明DOX-HIT-NPs不僅可以通過光熱作用殺死MCF-7/ADR細胞，還具有光動力治療的能力，可以利用產生活性氧的方式來殺死MCF-7/ADR細胞。另外，細胞實驗結果還表明DOX-HIT-NPs能夠增加MCF-7/ADR對DOX的攝取，對逆轉耐藥起到積極的作用；與游離DOX組和DOX-HIT-NPs組相比，用DOX-HIT-NPs加光照治療后，顯著抑制了MCF-7/ADR細胞的增殖，說明DOX-HIT-NPs可以通過聯合化學治療、光熱治療和光動力治療來殺傷MCF-7/ADR細胞，達到逆轉耐藥的效果。

綜上所述，DOX-HIT-NPs可以將TOS抗腫瘤作用、化學治療、光熱治療和光動力治療等多種作用有機整合在一起，對耐藥細胞株MCF-7/ADR細胞表現出顯著的殺傷效果，加上DOX-HIT-NPs使用的原料已為FDA批準使用，具有優良的生物相容性，因而，DOX-HIT-NPs有望為多藥耐藥腫瘤的臨床治療提供新的策略。