磁性二硫化鎢的層層自組裝修飾：光熱-化療協(xié)同抗腫瘤

謝萌， 楊眉， 楊娜， 鄧彤彤

(江蘇大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

目前，癌癥仍然是困擾人類健康問(wèn)題的重大疾病之一[1]。癌癥的治療方法有很多，光熱治療是近年發(fā)展起來(lái)的新型治療方式，具有微創(chuàng)、操作簡(jiǎn)單、效率高的優(yōu)點(diǎn)[2-3]。但長(zhǎng)期的單一治療會(huì)對(duì)周圍正常組織造成不可避免的附帶損傷[4]。因此，當(dāng)前的研究集中于多元協(xié)同治療，如光熱-化療聯(lián)合治療等[5-6]。

過(guò)渡金屬二硫化鎢(WS2)具有優(yōu)異的藥物負(fù)載性能和良好的近紅外吸收能力[7-9]，在臨床成像和癌癥治療領(lǐng)域具有良好的發(fā)展?jié)摿10-11]。將氧化鐵摻入WS2中構(gòu)成復(fù)合材料時(shí)，可以額外表現(xiàn)出良好的磁靶向和超順磁性，在外加磁場(chǎng)作用下可以定向進(jìn)入癌細(xì)胞。同時(shí)，研究表明氧化鐵具有磁熱和光熱轉(zhuǎn)化特性，產(chǎn)生的熱能對(duì)癌細(xì)胞造成不可逆的損傷，可以進(jìn)一步提高WS2的光熱性能[12]。

然而，WS2在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定性差，進(jìn)入體內(nèi)后易被免疫系統(tǒng)吞噬[13]。因此，本文旨在合成磁性二硫化鎢(magnetic WS2, mWS2)提高光熱性能并層層自組裝對(duì)其修飾改性，以提高其在生理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性，增加體內(nèi)的循環(huán)周期，達(dá)到更加高效的治療效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

小片徑單層WS2納米片(南京先豐納米材料科技有限公司)；殼聚糖(CS，南京奧多福尼生物科技有限公司)；多柔比星(DOX，大連美侖生物有限公司)；羧甲基纖維素(CMC)、牛血清白蛋白、無(wú)水乙酸鈉、六水合三氯化鐵及其他分析純?cè)噭?國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；人源性乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；Tecnai G2 F30 S-TWIN場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(美國(guó)FEI公司)；Nano Brook 90 Plus PALS分析儀(美國(guó)布魯克海文儀器公司)。

1.2 mWS2的制備

稱取0.036 g WS2置于干燥燒杯中，加入0.5 mL乙二醇、9.5 mL二乙二醇、0.18 g六水合三氯化鐵、0.05 g丙烯酸鈉和0.75 g醋酸鈉，室溫下機(jī)械攪拌1 h。將上述溶液裝入反應(yīng)釜中，200 ℃條件下反應(yīng)24 h。隨后將樣品13 500 r/min離心30 min，去除上清液。沉淀使用乙醇和超純水依次洗滌，然后分散至去離子水中，得到1 mg/mL 的mWS2溶液。

1.3 mWS2-CS的合成

稱取0.04 g CS，分散于30 mL 0.6%冰醋酸溶液中，超聲至溶解后，調(diào)節(jié)pH值至5.5～6.0，用去離子水定容至40 mL。在機(jī)械攪拌下緩慢滴加10 mL mWS2溶液。30 min后用0.22 μm濾膜過(guò)濾并收集沉淀，用去離子水洗滌后分散于50 mL水中，超聲分散并通入氮?dú)?，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 mWS2-CS/CMC的合成

稱取0.04 g CMC，加入200 mL去離子水，探頭超聲10 min。在機(jī)械攪拌作用下緩慢滴加20 mL mWS2-CS溶液。30 min后用0.22 μm濾膜過(guò)濾，收集沉淀并分散于20 mL去離子水中，超聲分散并通入氮?dú)?，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 磁性考察及形貌表征

分別取適量的mWS2、mWS2-CS/CMC樣品置于5 mL玻璃瓶中，將一塊強(qiáng)磁鐵置于玻璃瓶一側(cè)，放置一段時(shí)間后觀察磁性。另取適量mWS2材料烘干，使用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)進(jìn)行磁性能檢測(cè)。

將樣品稀釋至0.1 mg/mL滴加到銅片上，溶劑揮發(fā)后進(jìn)行透射電鏡表征；將10 μg/mL的樣品滴加在云母片上均勻鋪平，待溶劑揮發(fā)后使用原子力顯微鏡進(jìn)行觀察和拍攝。

1.6 穩(wěn)定性考察

取0.02 mg/mL的mWS2、mWS2-CS和mWS2-CS/CMC溶液，依次加入等量去離子水、PBS緩沖液和RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)。常溫下避光靜置，記錄樣品的穩(wěn)定情況。

1.7 光熱性能考察

將材料mWS2和mWS2-CS/CMC分別稀釋到0.2、0.1、0.05 mg/mL，用808 nm，2 W/cm2的經(jīng)近紅外激光(NIR)照射10 min，用紅外熱像儀檢測(cè)溫度，每30 s記錄一次。

1.8 非特異性蛋白吸附

將樣品與牛血清白蛋白溶液按照質(zhì)量比1 ∶2進(jìn)行非特異蛋白吸附考察。37℃恒溫振蕩24 h，取出后離心棄沉淀，檢測(cè)上清液的熒光值即可計(jì)算出牛血清白蛋白吸附率。

1.9 藥物負(fù)載

稱取適量的DOX溶于純水中，超聲分散，配制成1 mg/mL的溶液。按照DOX與材料的質(zhì)量比2 ∶1進(jìn)行載藥，37℃恒溫振蕩24 h。隨后取出樣品，13 500 r/min離心30 min，取上清液測(cè)量光密度并計(jì)算載藥量。

1.10 體外釋藥

將DOX、mWS2-DOX、mWS2-CS/CMC-DOX用PBS分別稀釋至1 mL后置于透析袋中,將透析袋分別放入裝有20 mL 不同pH值PBS緩沖液的離心管中，37℃下進(jìn)行藥物釋放考察，并在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，測(cè)量透析液的熒光值并計(jì)算釋藥量(激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為591 nm，狹縫10 nm)。

此外，將載藥后的沉淀分別用pH5.0和pH7.4的PBS分散至1 mL進(jìn)行近紅外促進(jìn)藥物釋放考察。光照組用808 nm, 2 W/cm2的近紅外激光照射8 min，37℃ 振蕩30 min，離心并吸取0.8 mL上清液測(cè)熒光，計(jì)算藥物釋放量。重復(fù)此步驟，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)定。非光照組除了不用光照之外，其他步驟均與光照組相同。

1.11 細(xì)胞攝取

將MCF-7細(xì)胞接種于玻底培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)，加入摻雜了熒光基團(tuán)FITC的mWS2-CS/CMC材料。攝取2 h后，用4%多聚甲醛固定，并用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。染色完成后滴加防熒光淬滅劑，激光共聚焦顯微鏡觀察材料在細(xì)胞內(nèi)的分布和攝取情況。

1.12 細(xì)胞毒性

將MCF-7細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，將載藥前后的mWS2、mWS2-CS/CMC稀釋為不同濃度加入培養(yǎng)板中，加入PBS緩沖液的細(xì)胞作為對(duì)照。隔天通過(guò)MTT法測(cè)定細(xì)胞的相對(duì)存活率。

1.13 體外光熱-化療聯(lián)合治療

將樣品分為6組進(jìn)行光熱-化療聯(lián)合治療考察。第1組：PBS；第2組PBS+NIR；第3組：mWS2-CS/CMC；第4組：mWS2-CS/CMC+NIR；第5組：mWS2-CS/CMC-DOX；第6組：mWS2-CS/CMC-DOX+NIR(DOX=25 μg/mL)

將MCF-7細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，將上述組別分別加入培養(yǎng)板中，并對(duì)第2、4、6組進(jìn)行808 nm，2 W/cm2的激光照射處理。隨后在37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，并通過(guò)MTT法測(cè)定細(xì)胞的相對(duì)存活率，以此來(lái)考察光熱-化療聯(lián)合治療的效果。

1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 磁性考察及形貌表征

由mWS2和mWS2-CS/CMC的磁性考察結(jié)果(圖1A、1B)可以看出，24 h后樣品均被吸附在靠近磁鐵的玻璃壁上，表明所合成的材料具有良好的磁性，且修飾后合成材料的磁性并沒(méi)有減弱。由圖1C可見，mWS2的磁滯曲線呈標(biāo)準(zhǔn)的S型，幾乎沒(méi)有出現(xiàn)磁滯現(xiàn)象。

mWS2的透射電鏡(圖1D)可見，F(xiàn)e3O4磁性粒子均勻分布在WS2片層上，沒(méi)有明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象。原子力顯微鏡(圖1E、1F)顯示mWS2的厚度約為20 nm，粒徑在200 nm左右，經(jīng)過(guò)自組裝修飾后，厚度增加到80 nm，粒徑增至400 nm左右，表明mWS2-CS/CMC成功制備。

A、B：mWS2和mWS2-CS/CMC的磁性考察照片；C：mWS2的磁滯曲線；D：mWS2的透射電鏡圖(×97000)；E、F：mWS2和mWS2-CS/CMC的原子力顯微鏡圖

圖1 材料磁性及形貌表征

2.2 粒徑和電位

WS2在經(jīng)過(guò)氧化鐵、CS、CMC修飾后，粒徑不斷增大(圖2)，表明外殼材料成功地對(duì)核心進(jìn)行了修飾。此外，合成的材料粒徑屬于納米級(jí)別，可以較好地用于藥物負(fù)載。樣品的Zeta電位圖可見，WS2帶負(fù)電，磁性粒子修飾WS2并不改變其帶電情況；mWS2-CS帶正電，說(shuō)明CS成功包裹到mWS2表面；mWS2-CS/CMC帶負(fù)電，說(shuō)明CMC成功包裹到mWS2-CS表面。此現(xiàn)象符合層層自組裝原理，且合成的最終材料帶負(fù)電有利于其在水中的穩(wěn)定性。

圖2 WS2、mWS2、mWS2-CS、mWS2-CS/CMC的粒徑和電位圖

2.3 穩(wěn)定性考察

由圖3可以看出，避光靜置24 h時(shí)mWS2和mWS2-CS在純水、PBS緩沖液和細(xì)胞培養(yǎng)液中均出現(xiàn)了部分沉淀，而mWS2-CS/CMC在3種溶液中均無(wú)沉淀產(chǎn)生，說(shuō)明其穩(wěn)定性在修飾后得到了明顯提升，適合作為藥物載體。

由左至右依次為純水、pH為7.4的PBS緩沖液、含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液

圖3 mWS2、mWS2-CS和mWS2-CS-CMC的穩(wěn)定性考察

2.4 光熱升溫

不同濃度WS2、mWS2和mWS2-CS/CMC的光照升溫曲線(圖4)表明，0.2 mg/mL WS2的最高溫度為61℃，同濃度條件下的mWS2最高溫度則升至72℃，在進(jìn)行自組裝修飾后，濃度為0.2 mg/mL的mWS2-CS/CMC最高溫度仍可達(dá)到68℃。當(dāng)濃度較低時(shí)，mWS2和mWS2-CS/CMC的溫度也可以達(dá)到42℃以上，證明磁性納米粒子的摻入使WS2的光熱性能得到了明顯提升。

圖4 WS2、mWS2和mWS2-CS/CMC的體外升溫曲線圖

2.5 非特異性蛋白吸附

如圖5A所示，WS2吸附率為157.89%，mWS2的蛋白吸附率降至121.96%，mWS2-CS/CMC只有76.21%。結(jié)果表明，WS2經(jīng)過(guò)一系列修飾后，表面的親水性增加，降低了非特異性蛋白的吸附率，避免藥物載體材料在進(jìn)入人體后被巨噬細(xì)胞攝取吞噬，降低炎癥反應(yīng)發(fā)生的概率，提高藥物的療效和生物利用度。

2.6 藥物負(fù)載

結(jié)果表明，mWS2-CS/CMC的載藥量為138.44%，表現(xiàn)出了優(yōu)異的藥物負(fù)載量(圖5B)。mWS2經(jīng)過(guò)CS和CMC修飾后，其載藥穩(wěn)定性得到極大的改善，在生理環(huán)境下基本不會(huì)發(fā)生聚沉(圖5C)。熒光全波長(zhǎng)掃描光譜圖顯示(圖5D)，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm時(shí)，DOX在520～650 nm有很強(qiáng)的熒光吸收，而mWS2-DOX、mWS2-CS/CMC-DOX在全波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度都很小，說(shuō)明藥物載體mWS2、mWS2-CS/CMC對(duì)藥物表現(xiàn)出一定的熒光淬滅作用，表明藥物成功負(fù)載到WS2片層上，而不是吸附在修飾材料表面。

A：WS2、mWS2和mWS2-CS/CMC非特異蛋白吸附率；B：WS2、mWS2和mWS2-CS/CMC的藥物負(fù)載率；C：DOX(左)、mWS2-DOX(中)及mWS2-CS/CMC-DOX(右)穩(wěn)定性照片；D：熒光全波長(zhǎng)掃描(激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，掃描波長(zhǎng)為520～650 nm)

圖5 材料的非特異蛋白吸附和藥物負(fù)載性能

2.7 藥物釋放

圖6A為mWS2-DOX和mWS2-CS/CMC-DOX在168 h內(nèi)的藥物釋放曲線，結(jié)果表明，藥物在pH5.0溶液中的釋放量高于pH7.4環(huán)境。從圖6B可以看出mWS2-CS/CMC-DOX在有(無(wú))近紅外光照射時(shí)，藥物在酸性條件下的釋藥率均高于中性，這與體外藥物釋放曲線一致。

A：不同pH條件下mWS2-DOX和mWS2-CS/CMC-DOX的藥物釋放；B：4 h內(nèi)在有(無(wú))近紅外光的情況下mWS2-CS/CMC-DOX在不同pH條件下的釋放情況

圖6 材料的藥物釋放考察

此外，在pH 5.0時(shí)，近紅外光照組的釋藥明顯增強(qiáng)，說(shuō)明近紅外光可以促進(jìn)藥物的釋放，表現(xiàn)出pH和NIR雙響應(yīng)的釋放曲線。人體內(nèi)的生理環(huán)境為中性，而腫瘤部位環(huán)境偏酸性。本實(shí)驗(yàn)中DOX在偏酸性的環(huán)境中釋放量大，有利于殺死腫瘤細(xì)胞，而減少對(duì)正常細(xì)胞的傷害。

2.8 細(xì)胞攝取和細(xì)胞毒性

MCF-7對(duì)mWS2-CS/CMC的攝取熒光圖顯示(圖7A)，DAPI染色的細(xì)胞核產(chǎn)生藍(lán)色熒光，而產(chǎn)生綠色熒光的mWS2-CS/CMC-FITC可以被細(xì)胞攝取并且分布在細(xì)胞質(zhì)中，表明所合成的材料生物相容性好，能成功進(jìn)入癌細(xì)胞。

不同濃度梯度mWS2-CS/CMC對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用表明(圖7B)，在材料和MCF-7細(xì)胞共孵育24 h后，細(xì)胞的相對(duì)存活率均高于90%，表明mWS2-CS/CMC在一定濃度范圍內(nèi)幾乎不存在對(duì)細(xì)胞的毒性，是一種安全理想的藥物載體。從圖7C可以看出，載藥后的mWS2-CS/CMC-DOX同樣可以進(jìn)入MCF-7，并且對(duì)癌細(xì)胞產(chǎn)生濃度依賴的殺傷作用，隨著濃度的不斷升高，細(xì)胞的相對(duì)存活率不斷降低，且修飾后的mWS2-CS/CMC相對(duì)于mWS2更容易進(jìn)入癌細(xì)胞，表現(xiàn)出更理想的殺傷效果。

mWS2-CS/CMC在生理?xiàng)l件下具有良好的分散性和穩(wěn)定性，且載藥量高，光熱升溫性能好，因此可以作為一種優(yōu)異的藥物載體構(gòu)建光熱-化療聯(lián)合治療的納米平臺(tái)。體外細(xì)胞的光熱-化療聯(lián)合治療效果如圖8所示，當(dāng)DOX含量為25 μg/mL時(shí)，單一光療組的細(xì)胞存活率約為50%，單一化療組細(xì)胞存活率約為35%，而聯(lián)合組表現(xiàn)出比單一組優(yōu)異的細(xì)胞殺傷作用，同樣時(shí)間處理后，細(xì)胞存活率降至20%以下。近紅外光照射既可以造成一定的光熱消融效果，還可以在腫瘤酸性條件下促進(jìn)藥物的釋放，使其聯(lián)合治療效果達(dá)到最大化，從而證明mWS2-CS/CMC作為一種藥物載體材料在光熱治療和光熱-化療聯(lián)合治療領(lǐng)域表現(xiàn)出了良好的應(yīng)用潛力。

A：MCF-7對(duì)mWS2-CS/CMC的攝取熒光圖；B：不同濃度mWS2、mWS2-CS/CMC與MCF-7共孵育24 h后的細(xì)胞毒性；C：游離DOX、mWS2-DOX、mWS2-CS/CMC-DOX與MCF-7共孵育24 h的細(xì)胞存活率

圖7 細(xì)胞攝取和細(xì)胞毒性考察

圖8 不同處理組的MCF-7細(xì)胞的存活率

3 討論

近幾年，光熱治療因其起效快、治療時(shí)間短、創(chuàng)傷小的優(yōu)勢(shì)而得到快速發(fā)展。但是激光隨著組織深度的增加會(huì)減弱，所以需要增加光照功率和時(shí)長(zhǎng)達(dá)到消融理想溫度，這將導(dǎo)致對(duì)周圍正常組織造成不可避免的附帶損傷，從而限制其進(jìn)一步應(yīng)用。因此，當(dāng)前的研究熱點(diǎn)開始集中于多元協(xié)同治療，通過(guò)構(gòu)建一定的載藥平臺(tái)，取長(zhǎng)補(bǔ)短，以達(dá)到更加全面的治療效果。

本課題組之前成功制備了CS/海藻酸鈉和CS/葡聚糖自組裝修飾的磁性氧化石墨烯[14-15]，并考察了其單獨(dú)光熱消融癌細(xì)胞的效果，結(jié)果顯示，當(dāng)材料濃度達(dá)到50 μg/mL時(shí)，激光可以對(duì)50%左右的癌細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，說(shuō)明磁性粒子對(duì)氧化石墨烯的修飾取得了一定的效果。盡管如此，當(dāng)適量地降低載體濃度時(shí)，磁性氧化石墨烯仍無(wú)法達(dá)到理想的光療效果，因此本研究選用光熱性能更好的WS2，一種類氧化石墨烯的二維納米層狀材料，并利用生物相容性更加優(yōu)異的CMC和CS對(duì)其進(jìn)行自組裝修飾，制備分散性良好的mWS2-CS/CMC納米復(fù)合材料。

研究發(fā)現(xiàn)，所合成的材料具有良好的磁性響應(yīng)，并且當(dāng)去掉外磁場(chǎng)后，剩磁很快會(huì)消失，表明mWS2-CS/CMC具有超順磁性，在外加磁場(chǎng)的作用下，可以定向進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到高效的藥物傳遞效果。此外，穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，其在生理環(huán)境中分散性好，穩(wěn)定性高，且非特異性蛋白吸附量小，進(jìn)入體內(nèi)后可以避免自身團(tuán)聚或?qū)Ψ翘禺惖鞍椎拇罅课?，從而降低被免疫系統(tǒng)清除吞噬的概率，減少炎癥反應(yīng)發(fā)生的同時(shí)還可以提高在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，達(dá)到長(zhǎng)效的藥物傳遞效果。

對(duì)藥物負(fù)載和釋放性能的研究顯示，mWS2-CS/CMC對(duì)抗腫瘤藥物DOX有很好的負(fù)載能力，且載藥穩(wěn)定性好，體外的藥物釋放表現(xiàn)出pH和NIR的雙響應(yīng)曲線，酸性條件下NIR照射后可以大量釋放藥物。由于癌細(xì)胞內(nèi)的酸性環(huán)境以及材料磁靶向的定位性能，使其負(fù)載的藥物在癌細(xì)胞內(nèi)得到充分釋放，從而達(dá)到理想的治療效果。mWS2-CS/CMC在體外還具有良好的光照升溫效果，在低濃度時(shí)，短時(shí)間就可以升至光熱消融的理想溫度，可以作為一種優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)化劑應(yīng)用于光熱治療領(lǐng)域。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，mWS2-CS/CMC可以很好地被MCF-7細(xì)胞攝取，并蓄積分布在細(xì)胞質(zhì)中，載體本身對(duì)癌細(xì)胞幾乎不產(chǎn)生毒性，載藥后則可以表現(xiàn)出濃度依賴的殺傷特性。

受到之前對(duì)磁性氧化石墨烯研究的啟發(fā)，本研究設(shè)計(jì)了光熱-化療聯(lián)合抗癌的實(shí)驗(yàn)方案，通過(guò)考察單一光療、單一化療和聯(lián)合治療的效果對(duì)其抗癌性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究表明，聯(lián)合治療組比單一治療組表現(xiàn)出更加優(yōu)異的癌細(xì)胞殺傷效果，并且在25 μg/mL時(shí)，聯(lián)合治療組就可以殺死80%的MCF-7細(xì)胞，比磁性氧化石墨烯的效果有了大幅提升。

綜上，本研究設(shè)計(jì)并制備的mWS2-CS/CMC可以作為理想的藥物載體應(yīng)用于癌癥治療領(lǐng)域，為腫瘤的多元多通道治療提供新的設(shè)計(jì)思路。