盤狀結構域受體1對高糖誘導血管內皮凋亡的影響

趙為陳，沈炳香，何春遠，王法財，江俊麟

(1.安徽醫科大學附屬六安醫院藥學部，安徽 六安 237005；2.中南大學湘雅藥學院藥理學系，湖南 長沙 410078)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種慢性代謝性疾病，是繼心血管疾病、腫瘤之后的第三大健康殺手，預計到2030年，全球糖尿病患者將達到4億3900萬，約占世界人口的7.7%[1]。糖尿病易引發血管并發癥，可導致心、腦、腎等器官功能損傷和衰竭[2]。血管內皮損傷被認為是糖尿病血管病變的起始階段，內皮細胞凋亡是導致內皮損傷的主要原因。因此，如何阻止和減少血管內皮細胞凋亡，對于改善糖尿病患者血管內皮功能，預防和治療糖尿病血管病變具有重要意義。

細胞凋亡是以caspase-3誘導細胞主動的程序性、非炎癥性細胞死亡，主要表現為細胞質和細胞核固縮、DNA及核酸酶裂解、凋亡小體形成，但是保留細胞質膜的完整性[3]。研究表明，高糖可通過上調Bax蛋白，下調Bcl-2蛋白，誘導血管內皮細胞凋亡，進而導致血管內皮損傷[4]。盤狀結構域受體1(discoidin domain receptor 1，DDR1)是一種非整合素膠原受體，為受體酪氨酸激酶家族成員之一，由胞外區、跨膜區和胞內激酶區3部分組成，參與包括細胞炎癥、增殖、分化在內的病理生理過程[5-6]。研究表明[7]，DDR1在上皮細胞和平滑肌細胞中呈現高表達，可促進E鈣粘蛋白介導細胞間黏附，維持上皮細胞的完整以及促進平滑肌細胞增殖。但是關于DDR1在糖尿病血管內皮損傷中的研究尚不清楚。本研究擬從動物和細胞水平，探究DDR1在糖尿病血管內皮損傷中的作用及其對內皮細胞凋亡的影響。

1 材料

1.1 實驗動物購自中南大學湘雅醫學院動物學部，體質量為(200±20) g，♂，SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠40只(合格證號：43004700029598)。

1.2 實驗細胞人臍靜脈內皮細胞株(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購自美國模式菌種收集中心(ATCC)(貨號：CAL-1730)。

1.3 抗體與試劑DDR1(#3917)、caspase-3(#9662)、Bax(#2772)和Bcl-2(#3498)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；β-actin抗體(AF0003)、HRP標記兔二抗(A0277)和鼠二抗(A0286)均購自江蘇碧云天公司；一抗稀釋液(P0023A-100ml)、二抗稀釋液(P0023D-100ml)以及Hoechst 3342染色試劑盒(C1026)均購自江蘇碧云天公司；兔SP試劑盒(兔鏈卵白素-生物素法檢測系統)(SP-9001)購自北京中杉生物技術公司；D-glucose溶液(G3285)購自美國Sigma公司；DMEM低糖培養基(C11885500BT)購自以色列BI公司。

1.4 儀器小動物超聲成像系統(加拿大Visual Sonics公司)；倒置相差熒光顯微鏡(日本尼康公司)；ChemiDoc XRS+成像系統(美國Bio-Rad公司)；Western blot裝置(美國 Bio-Rad公司)；組織勻漿儀(武漢維塞爾生物科技有限公司)；恒溫CO2細胞培養箱(美國Thermo公司)；高速冷凍離心機(美國 Beckman-Coulter 公司)；細胞裂解破碎儀(寧波新芝生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 糖尿病大鼠模型構建健康♂，SD大鼠，體質量為(200 ±20)g，適應性喂養1周后，一次性腹腔內注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(60 mg·kg-1，用0.05 mol·L-1檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液新鮮配制)，對照組的大鼠腹腔注射等容積的檸檬酸緩沖液。在注射STZ后d 3檢測血糖，大鼠尾靜脈取血，血糖連續3 d≥16.7 mmol·L-1歸為糖尿病模型組。實驗期間定期檢測體重、血糖、血脂、空腹胰島素等。

2.2 血管多普勒超聲對正常組大鼠(n=6)和糖尿病大鼠(n=6)進行主動脈血管多普勒超聲檢測。獲取大鼠二維主動脈M型超聲、彩色血流、血流頻譜圖像。測定M型血管超聲圖像中內中膜厚度(IMT)和管腔內徑大小(AD)，血流頻譜圖像中主動脈收縮最大血流速度(PSV)和主動脈舒張末期血流速度(EDV)大小，并對血管阻力指數(RI=PSV-EDV/PSV)進行計算。以上實驗開展均由同一人員進行操作，所有實驗參數測定3次，取平均值為最終檢測結果。

2.3 蘇木精-伊紅(HE)染色大鼠心臟取血完成后，剪開左心耳并采用4%多聚甲醛持續灌流至心臟、肺呈乳白色，隨后完全打開大鼠胸腔并沿連接心臟主動脈弓位置處緊貼著大鼠脊柱方向剪取主動脈，隨后放置于預冷的生理鹽水內并剔除血管外周結締組織，主動脈組織4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色。

2.4 免疫組化主動脈血管切片經過脫蠟、清洗后按照北京中杉金橋公司兔SP-9001檢測試劑盒說明書進行操作：① 組織抗原修復：于90 ℃條件下，水浴25 min；② 阻斷：室溫條件下，滴加3% H2O2溶液阻斷劑，孵育15 min；③ 封閉：5% BSA溶液封閉30 min；④ 孵育一抗：4 ℃ 條件下，DDR1一抗(1∶ 200)孵育過夜；⑤ 孵育二抗：室溫條件下，孵育二抗約30 min；⑥ 顯色，拍照：滴加DAB顯色液，染色約5 min，顯微鏡下觀察DDR1表達與分布并拍照。

2.5 細胞培養與處理HUVECs用含10% FBS的DMEM低糖培養基(5.5 mmol·L-1)培養，隔天換液，待細胞生長融合至90%時采用胰酶(含0.25%胰酶和0.01% EDTA)消化、傳代、種板。在CO2含量5%，溫度為37 ℃條件下，培養細胞。待培養板內細胞生長密度達到40%～50%時，同步化(含1% FBS的DMEM低糖培基)處理24 h。實驗分組、處理情況如下： ① 高糖處理HUVECs 實驗：Control組(5.5 mmol·L-1)、HG組(33 mmol·L-1D-glucose)；② DDR1 siRNA干擾處理實驗：Control組(5.5 mmol·L-1)、HG組(33 mmol·L-1D-glucose)、DDR1 siRNA+HG組(轉染DDR1 siRNA 24 h，后高糖處理48 h)、NC+Control組(轉染DDR1無關片段24 h，后正常糖濃度下培養48 h)。

2.6 Hoechst染色采用Hoechst法檢測HUVECs凋亡，按照江蘇碧云天公司Hoechst染色試劑盒說明書進行操作：① 24孔板培養的HUVECs，處理結束后，去除細胞培養液，PBS潤洗2次，每次3 min；② 加入細胞固定液，室溫固定10 min；③ 去除細胞固定液，PBS潤洗2次，每次3 min；④ 吸盡液體，每孔加入250 μL Hoechst 3342染色液，避光染色5 min；⑤ 去除染色液，PBS潤洗2次，每次3 min，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.7Westernblot大鼠主動脈血管組織和HUVECs使用組織細胞裂解液裂解后，高速離心機4 ℃，12 000×g離心15 min，收集各自上清液，采用BCA法進行蛋白質濃度定量檢測。按照每孔上樣量為30 μg進行蛋白質凝膠電泳實驗。根據目的蛋白分子量大小以及蛋白marker指示進行切膠，濕轉轉膜法將蛋白轉移至PVDF膜上，脫脂牛奶封閉2 h，孵育對應一抗(1 ∶ 1 000)4 ℃過夜，含吐溫磷酸鹽緩沖液(TPBS)洗滌3次，每次5 min，孵育二抗(1 ∶ 5 000)1 h，TPBS洗膜后加入發光聚合物(ECL)，使用膠片曝光，圖片掃描后用 Image J 軟件計算各條帶的灰度值，以各目標條帶灰度值與內參β-actin條帶灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達量。

3 結果

3.1 糖尿病血管內皮損傷模型建立為了探究高血糖對血管內皮損傷的影響，我們通過大鼠腹腔注射STZ造模12周。結果顯示，糖尿病大鼠血糖異常增高(P<0.01)、血漿胰島素含量和體重均顯著降低(P<0.01)(Tab 1)。血管多普勒超聲結果顯示，糖尿病大鼠主動脈血管IMT和RI顯著增加(P<0.01)，AD、PSV和EDV均顯著降低(P<0.01)(Tab 1、Fig 1A)。HE染色結果顯示，糖尿病大鼠主動脈內皮粗糙，出現明顯隆起，褶皺且排列紊亂，呈現波浪形(Fig 1B)。以上研究表明，糖尿病血管內皮損傷模型建立成功。

Tab 1 Comparison of general index levels between two groups of

**P<0.01vscontrol

Fig 1 Effects of hyperglycemia on vascular endothelial structure and function in

A: Detection of rat aortic endothelial function by vascular Doppler ultrasound. B: Detection of rat aortic vascular endothelial structure by HE staining.

3.2 高糖對血管內皮凋亡的影響為探究糖尿病血管內皮損傷時，是否有內皮細胞凋亡發生。我們通過動物與細胞實驗相結合進行驗證。Western blot檢測結果顯示，糖尿病大鼠主動脈組織Bax和caspase-3表達均顯著增加(P<0.01，P<0.05)，Bcl-2表達顯著降低(P<0.05)(Fig 2A)。高糖處理HUVECs 48 h可誘導Hoechst陽性細胞增加(P<0.01)，促進Bax和caspase-3表達(P<0.01)，抑制Bcl-2表達(P<0.05)(Fig 2B、2D、2E、2F)。上述結果表明，細胞凋亡參與了糖尿病血管內皮損傷過程。

3.3 高糖對血管內皮DDR1蛋白表達的影響為探究血管內皮凋亡的發生機制，我們通過Western blot和免疫組化檢測DDR1表達與分布情況。結果顯示，糖尿病大鼠主動脈組織DDR1蛋白表達顯著增加(Fig 3A、3B)(P<0.01)。通過體外細胞實驗發現，高糖處理HUVECs 48 h可顯著上調DDR1蛋白表達(Fig 3D)(P<0.01)。提示DDR1可能參與高糖誘導的血管內皮損傷。

3.4 抑制DDR1對高糖誘導內皮細胞凋亡的影響為確證DDR1與高糖誘導血管內皮細胞凋亡之間的關系，我們通過轉染DDR1 siRNA 24 h后，高糖處理HUVECs 48 h。Hoechst染色法檢測細胞凋亡情況，Western blot檢測凋亡相關蛋白表達。結果顯示，抑制DDR1可顯著降低高糖誘導HUVECs Hoechst陽性細胞率增加(P<0.05)(Fig 4A、4B)，Bax和caspase-3表達的上調(P<0.05)，Bcl-2表達的下調(P<0.05)(Fig 4C、4D)。提示抑制DDR1可以降低高糖誘導的血管內皮凋亡，緩解內皮損傷。

4 討論

糖尿病的微血管和大血管并發癥可引起心、腦、腎、眼底、下肢等重要組織器官供血不足和功能喪失，是導致糖尿病患者高致殘率和高死亡率的主要原因[8]。血管內皮損傷是糖尿病血管病變的始動因素。內皮細胞是血液與血管壁之間最重要的一層保護屏障，高糖可加速內皮細胞凋亡，引發血管病變[9-11]。在本研究中，我們通過STZ誘導糖尿病大鼠和高糖處理HUVECs 48 h，觀察糖尿病環境下血管內皮凋亡情況。在STZ誘導的糖尿病大鼠(12周)，我們通過主動脈血管多普勒超聲和HE染色檢測血管內皮損傷情況，Western blot檢測大鼠主動脈組織凋亡相關蛋白caspase-3、Bax和Bcl-2表達變化。結果顯示，相比正常對照組大鼠，糖尿病組大鼠主動脈內中膜厚度增厚、管腔內徑變小、主動脈收縮最大血流速度和主動脈舒張末期血流速度明顯減小，同時出現血管內膜粗糙，褶皺顯著且排列紊亂，表明血管內皮功能損傷；Western blot結果顯示，Bax和caspase-3表達顯著上調，Bcl-2表達顯著下調。進一步細胞實驗發現，高糖處理HUVECs 48 h可增加Hoechst陽性細胞率，且Bax和caspase-3表達顯著上調，Bcl-2表達顯著下調。上述動物和細胞實驗結果共同證實，高糖環境可誘導血管內皮細胞凋亡，進而導致糖尿病血管內皮損傷。

Fig 2 Effect of high glucose on vascular endothelial

DDR1為受體酪氨酸蛋白激酶，廣泛存在于腦、肺、腎、脾和胎盤等多種組織中，參與了包括細胞遷移、增殖、生存、分化以及細胞外基質重構在內的一系列生理和病理過程[12]。研究證實，在頸動脈球囊損傷內皮的小鼠模型，頸動脈中DDR1表達明顯上調，并伴隨平滑肌細胞增殖、遷移和膠原(I和VIII型)合成增加[13]。在基底膜成分α5(IV)敲除的人腦微血管內皮細胞，DDR1表達降低，并伴隨著內皮細胞增殖、遷移和小管形成的減少[14]。在人胚腎細胞膜上，高糖可促進DDR1蛋白的表達[15]。既往研究提示DDR1可能參與高糖誘導的血管內皮損傷。因此，在本研究中，我們通過Western blot和免疫組化共同檢測12周糖尿病大鼠主動脈組織DDR1蛋白表達與分布，結果顯示，相比正常對照組大鼠，糖尿病大鼠主動脈組織DDR1表達顯著升高。在培養的HUVECs，高糖處理48 h,結果顯示，相比對照組，高糖處理組可以顯著上調DDR1。基于本實驗結果高糖可誘導內皮細胞凋亡，促進DDR1表達。我們推測，糖尿病發生時，DDR1可能通過誘導內皮細胞凋亡，引起血管內皮功能損傷。為了確定DDR1在高糖誘導的血管內皮細胞凋亡中的作用，在本實驗中，我們進一步檢測siRNA DDR1對高糖誘導血管內皮細胞凋亡的影響。結果顯示，在培養的內皮細胞，DDR1 siRNA能顯著降低高糖誘導的Hoechst陽性細胞率增加，抑制Bax、caspase-3表達上調和Bcl-2表達下調。

Fig 3 Effect of hyperglycemia on DDR1 protein expression in vascular endothelial

Fig 4 Inhibition of DDR1 on high glucose-induced apoptosis of endothelial

A: Effect of DDR1 siRNA on the rate of apoptosis induced by high glucose in HUVECs. B: Percentage of Hoechst positive cells. C: Effect of DDR1 siRNA on high glucose-induced apoptosis-related proteins(Bax, Bcl-2, caspase-3) in HUVECs. D: Quantification of C. NC: DDR1 negative control.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsHG

綜上所述，本研究通過探討DDR1對高糖誘血管內皮凋亡的影響。結果發現，高糖可通過促進DDR1表達，誘導內皮細胞凋亡，進而導致血管內皮功能損傷。以上研究結果揭示了糖尿病血管內皮損傷的部分分子機制，為進一步靶向DDR1藥物治療奠定了理論基礎。