基于體外抗血小板聚集活性的丹參注射液生物活性測定法

婁天宇，李瑞吉，劉金輝，于尚玥，王志斌

(1. 北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102；2. 北京中醫藥大學北京中醫藥研究院，北京 100029)

丹參注射液是由丹參飲片經過水提醇沉等步驟制備而成的注射液，具有保護心腦血管、抗血小板聚集、抗菌、抗炎等藥理作用[1,2]，臨床上廣泛用于治療冠心病、心悸胸悶、心絞痛[3]。前期研究發現，丹參飲片中的主要藥效成分水溶性酚類在注射液制備過程中易損失[4]，導致不同廠家不同批次的丹參注射液質量存在差異。因此，當下亟待有綜合、整體、宏觀的評價方法來補充調整現行的質量控制標準。

生物活性測定法是采用恰當統計學檢驗方法對藥物的某種生物活性進行評價，是一種涵蓋藥理學和藥檢統計分析，可定量的活性測定方法[5]。目前，美國FDA《植物藥工業開發指南》，《中國藥典》(2015版)都將生物活性評價方法納入其中[6-7]，表明以生物活性作為中草藥、植物藥的一種質量評價模式已得到越來越多的重視和認可，生物活性測定法用于中藥質量控制已是一種必然的趨勢。

采用生物活性測定法建立一種反映丹參注射液有效性的新質控方法，對其現有的質量標準進行補充，能更好的評價丹參注射液的品質，提高相關中藥注射劑質量標準的發展速度，加快其有效性及安全性的研究與再評價的進程。

1 材料與方法

1.1 實驗動物日本大耳白家兔(北京維通利華實驗動物技術有限公司，二級標準)，♂，體重(2.1±0.5) kg；許可證號：SCXK(京)2006-0009。

1.2 供試藥品丹參注射液由A、B、C、D四個廠家提供，其中A、B、C廠家各2批次，D廠家3批次，均為提供部頒質量標準項下檢驗報告合格的藥品。藥品批號見Tab 1。

Tab 1 Different batches of Danshen injection sample information

1.3 儀器與試劑LBY-NJ4型半自動血小板聚集儀(北京瀚邦生物科技有限公司)，ADVIA 2120i型血細胞分析儀(美國SIEMENS公司)，0.9%氯化鈉注射液(中國大冢制藥有限公司，批號：0B72H2)，枸櫞酸鈉(天津市光復精細化工研究所，批號：20101025)血小板聚集功能AA激活檢測試劑盒(北京瀚邦生物科技有限公司，批號：401034)。

1.4 血漿制備家兔采取心臟取血，加入3.2%枸櫞酸納(1 ∶ 9)抗凝。抗凝血以160g，離心10 min，得到富血小板血漿(platelet rich plasma,PRP)，余下血液繼續2 000g，離心10 min，得貧血小板血漿(platelet poor plasma,PPP)。用血液分析儀測定PPP和PRP中的血小板個數，利用PPP稀釋調節PRP，使PRP中的血小板數在5×1011·L-1左右。為保證結果的可靠性，PPP和PRP應在室溫條件下，不可過度震蕩，且確保在4 h內完成血小板聚集的測定[8]。

1.5 樣品制備通過實驗室綜合評價，將D廠家(批號：1807242)丹參注射液為標準品，向其加入0.9%的生理鹽水。以0.85的劑間比分別配制濃度為100%、85%、72.3%、61.4%、52.2%、44.4%、37.7%、32.1%、27.3%的樣品各1 mL。取其他各廠家的丹參注射液，用0.9%的生理鹽水作為溶劑，以0.85的劑間比分別配制濃度為100%、85%、72.3%、61.4%、52.2%、44.4%、37.7%、32.1%、27.3%的供試品各1 mL，備用。

1.6 血小板聚集率測定取PPP 300 μL加入一次性測試杯，校準調零。取PRP 274 μL，分別加入不同濃度的樣品液10 μL，37 ℃孵育3 min，依次加入花生四烯酸(arachidonic acid,AA)16 μL，測定5 min內的血小板最大聚集率[9]。

1.7 統計分析各樣本效價數據及方法學考察結果應用中國藥典生物檢定統計程序BS2000進行統計分析。

2 結果

2.1 量效學考察結果在丹參注射液標準品(S)體外對抗血小板聚集的實驗中，發現血小板聚集率隨丹參注射液濃度增加具備量效關系。注射液濃度在27.3%～100%范圍內，量效關系顯著，可得線性方程為y=-1.21x+114.30，r2= 0.965 9。具體測定結果見Fig 1，Tab 2。丹參注射液供試品(T)量效學考察結果見Tab 3。綜合丹參注射液的量效學考察結果，發現注射液濃度在37.7%～52.2%范圍內，量效關系明顯，線性良好。

Fig 1 The dose-effect relationship of anti-platelet aggregation of standard Danshen injection

Tab 2 The dose-effect relationship of anti-platelet aggregation of standard Danshen injection (n=3)

根據量效關系考察結果，發現丹參注射液對AA誘導的血小板聚集率均隨濃度增加而成對數下降的趨勢。可采用生物活性測定法中的量反應平行線中三三法進行實驗設計，進一步篩選線性范圍，各批次線性考察結果見Fig 2。由圖中結果可知，丹參注射液濃度在37.7%～52.2%范圍內，線性較好，相關系數均在0.9以上，從而完成線性范圍篩選。

2.2 效價測定與可靠性，重復性考察結果

2.2.1效價測定 丹參注射液標準品(S)與供試品(T)按劑間比1 ∶ 0.85各配置高、中、低3個濃度，各濃度梯度均按照S1、T1、T2、S2、S3、T3的順序分別測定標準品組和供試品組三個含藥富血小板血漿的血小板最大聚集率，平行測定3次。規定以丹參注射液標準品效價為1 000 U/L，采用中國藥典生物檢定統計程序BS2000計算供試品組測得效價(PT)和可信限率(FL%)并進行可靠性檢驗，結果見Tab 4。

結果發現，不同廠家不同批次的丹參注射液效價測定結果不同，可信限率均小于10%，檢定結果精密度良好。與丹參注射液標準品相比，其中A廠家抑制血小板聚集活性較弱，D廠家與標準品活性相當，B和C廠家均強于標準品，更加明確直觀的反映出不同廠家的丹參注射液抑制血小板聚集作用的強弱，直關其藥效。

2.2.2可靠性檢驗結果 對不同批次的丹參注射液依次進行可靠性檢驗。結果顯示，變異來源中的回歸項均顯著，曲線、偏離平行和反向二次曲線(P>0.05)，差異均無統計學意義，表明標準品(S)和供試品(T)是兩條平行直線。實驗結果可以通過平行線測定的相關公式計算效價和估計相應實驗誤差。劑間P值小于0.01，差異均有顯著性，表明本次設計劑量、劑間比安排恰當，滿足實驗要求。證明本方法測得各批次效價可靠，可靠性通過。

2.2.3重復性考察結果 取丹參注射液(1807251)，按照2.2.1項下生物活性測定方法，分別配置6份標準品及供試品，重復測定六次效價，并進行可靠性檢驗，結果見Tab 5。由結果可知，6次測定結果為(1 030.38±1.93) U·L-1，測得結果均通過可靠性檢驗，可信限率(FL)平均值2.97%，小于5%，RSD%為0.137%，小于10%，說明該方法重復性較好。

3 討論

本實驗基于丹參注射液的抗血小板聚集活性對其進行量效學關系考察，利用量反應平行線中三三法進行實驗設計以及規定丹參注射液標準品的效價為1 000 U/L，從而測定其他丹參注射液供試品效價，測得效價可靠，重復性良好。該方法能夠更好的評價不同批次丹參注射液抗血小板聚集活性，衡量其藥效強弱，在綜合性全面評價其質量方面具有一定參考價值。

目前，中藥生物活性測定法仍在起步階段，尤其標準品的建立尚無成熟的參考原則。該實驗建立了丹參注射液體外抗血小板聚集活性的標準品，后期將組織不同實驗室對其進行協作標定，可進一步為標準品的建立提供實驗依據和技術支持。

近年來，中藥注射劑因其劑量小、生物利用度高、療效快、耐藥率低等特點，愈加廣泛的應用到臨床中，已成為無可替代的中藥新產品[10]。研究建立一種丹參注射液的新質量評價方法，必將極大的推進中藥注射液生物活性測定法進步。該方法的建立能夠為探討生物活性測定法在中藥質量控制方面提供方法學借鑒，進一步可為中藥標準品的建立及生物測定方法的研究開創新思路。

Tab 3 The dose-effect relationship of anti-platelet aggregation of Danshen injection (n=3)

-：indicate that it isn’t detected

Fig 2 The linear range of anti-platelet aggregation of Danshen injection

Tab 4 Potency of different batches of Danshen injection

Tab 5 Repetitive study on relative bioavailability potency of Danshen injection(n=6)