microRNA-25在結腸癌中的表達及臨床意義

殷小莉

結腸癌是消化系統常見的腫瘤，發病率以及病死率目前仍居高不下[1]。在發達國家，結腸癌在導致死亡的癌癥疾病中排第二位[2,3]。在我國，結腸癌的發病率也呈上升趨勢，且病死率亦明顯增加[4]。主要與高脂肪飲食和纖維素攝入不足有關[5]。其中，慢性結腸炎與結腸息肉患者的發病率明顯高于一般人群[6]。如果患者同時擁有家族性多發性息肉瘤，其癌變的發生率更高，可見遺傳因素在結腸癌的發生過程中起到十分重要的作用[7]。目前對結腸癌的篩查指標主要包括血清癌胚抗原CEA和糖蛋白CA19-9[8]。但是研究指出二者的敏感性較低[9]。作為診斷結腸癌的金標準的結腸鏡檢查，是一種有創檢查，患者接受度有待進一步提高[10]。如果能早期發現并明確診斷結腸癌，患者一般可以獲得良好的預后[11]。研究表明miRNA的表達調控異常將導致惡性腫瘤的發生[12]。microRNA-25在多種惡性實體腫瘤中表達上調，但是最新研究表明，microRNA-25既能作為癌基因又能作為腫瘤抑制基因，其功能十分復雜[13]。目前僅有少數研究通過體外細胞實驗探討microRNA-25 在結腸癌中的作用，但microRNA-25能否可以作為預測結腸癌發展變化的診斷指標尚不可知。本研究擬比較結腸癌患者與健康人血漿中microRNA-25的差異表達，并比較在淋巴結轉移、臨床分期及發生部位的不同，探討microRNA-25的臨床診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 經石家莊市第三醫院倫理委員會批準，收集2012年2月至2016年1月我院收治的50例結腸癌患者的血漿標本作為試驗組，其中男28例，女22例；年齡(59.32±11.09)歲。所有結腸癌患者經消化內鏡組織病理活檢確診且未經手術切除及放化學等治療，無其他系統疾病及腫瘤。另外選取50例與其年齡、性別及種族相匹配的健康體檢者的血漿作為健康組，其中男39例，女11例；年齡(58.12±10.49)歲；血漿標本獲取均征求了患者以及家屬的知情同意并簽署知情同意書。記錄2組患者的年齡、性別、TNM分期、有無淋巴結轉移、血清CEA水平以及結腸癌發生位置。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器:Trizol Reagent BD(美國ThermoFisher公司)；RT反轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒(陸恒生物有限公司)；microRNA-25以及內參U6引物由北京博奧森公司設計并合成； Nano-Drop2000C紫外分光光度計(美國賽默飛世爾公司)； 7500Fast qRT-PCR儀(美國羅氏公司)。

1.2.2 血漿中總RNA的提取:根據Trizol說明書提取血漿中的總RNA，過程如下參考[14]：將 1 ml的Trizol 于200 μl血漿震蕩混勻后靜置5 min，加入200 μl 氯仿，劇烈振蕩15 s；靜置5 min，4℃12 000×g離心15 min，吸取上層無色液相500 μl，加入500 μl異丙醇，顛倒混勻，靜置15 min，4℃12 000×g離心15 min，棄上清，加入75%乙醇1 ml混勻，4℃ 7 500×g離心5 min，棄上清自然干燥5 min,加入10 μl無RNA酶水溶解。冰盒運輸，采用Nano-Drop2000C紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，并選取光密度D260/D280 在1.4～1.8者作為下一步實驗對象。

1.2.3 反轉錄及qRT-PCR:反轉錄及qRT-PCR均按照說明書進行操作，具體如下：將提取的總RNA在42℃水中孵育20 min，然后在85℃孵育10 s。反轉錄條件如下： 95℃ 30 s ； 95℃ 5 s； 60℃30 s；共計40個循環。最后用7500Fast SystemSDS軟件計算出Ct值，結腸癌組和健康組的microRNA-25相對表達量以2-ΔΔCt計算。ΔΔCt=(Ct目的基因- Ct管家基因)試驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。

2 結果

2.1 2組外周血漿microRNA-25表達量比較 結腸癌組中與健康組中microRNA-25的相對表達量分別為(4.16±0.74)、(1.04±0.38)；2組差異有統計學意義(t=7.228,P=0.001)。見圖1。

圖1 結腸癌患者與健康組microRNA-25表達差異 (*P<0.05,與健康組比較)

2.2 結腸癌患者血漿中的microRNA-25在不同臨床病理資料間的差異性 血漿中的microRNA-25在不同臨床病理分級(TNM分期)間的表達差異：TMN分級越高血漿中microRNA-25的含量越低；差異有統計學意義(F=5.220,P=0.025)。兩兩比較發現：TNM Ⅲ期的microRNA-25的相對表達量明顯高于Ⅰ期的患者，差異有統計學意義(t=1.068,P=0.011)。見表1。

TNM分期microRNA-25的相對表達量F(t)值P值Ⅰ(n=6) 3.54±0.315.2200.025Ⅱ(n=14)3.86±0.47Ⅲ(n=15)4.22±0.44Ⅳ(n=15)5.10±0.38

2.3 血漿中microRNA-25的表達與淋巴結是否轉移的關系 淋巴結轉移陽性結腸癌患者microRNA-25表達明顯高于淋巴結轉移陰性結腸癌患者，差異具有統計學意義(t=4.402,P=0.032)。男性患者血漿中的microRNA-25表達量為(2.85±0.39)，女性患者血漿中的microRNA-25表達量(2.91±0.53)，2組比較差異無統計學意義(t=1.021,P=0.339)。根據55歲為年齡界限，其中<55歲與≥55歲結腸癌患者microRNA-25表達量差異無統計學意義(t=0.382,P=0.108)。microRNA-25與血清CEA以及結腸癌的位置并無明顯相關性。見表2。

項目microRNA-25的相對表達量F(t)值P值性別 男(n=30)2.85±0.391.0210.339 女(n=20)2.91±0.53年齡(歲) ≥55(n=34)4.35±0.410.3820.108 ≤55(n=16)4.51±0.48淋巴結轉移 陰(n=27)4.26±0.314.4020.032 陽(n=23)5.44±0.32血清CEA(μg/L) ≤3.4(n=36)4.35±0.187.5310.104 >3.4(n=14)3.87±0.25結腸癌位置 左半結腸(n=26)4.08±0.325.1030.299 右半結腸(n=24)4.11±0.25

2.4 microRNA-25作為生物標志物的靈敏性和特異性 microRNA-25作為結腸癌的生物標志物(AUC)曲線下的面積為0.906，診斷價值最高。以2.06為相對表達量的節點，特異度為66.7%和靈敏度為96.2%，尤登指數為0.85。見圖2。

圖2 microRNA-25作為診斷結腸癌的ROC曲線

3 討論

結腸癌的發病率處于惡性腫瘤的第三位，近些年來逐漸呈上升趨勢。由于早期癥狀不明顯，確診時通常已屬于中晚期，即使手術效果仍不理想[16]。晚期結腸癌5年生存率僅為25%，而早期的5年生存率約為90%[17,18]，因此，早期診斷篩查顯得尤為重要。臨床上應用結腸鏡組織活檢作為結腸癌篩選的首選方法[19]。但有研究指出此方法會造成腫瘤擴散且屬于有創檢查[20]。因此探討腫瘤的新標志物對早期發現診斷結腸癌并增加結腸癌患者的生存率至關重要[21]。

microRNA是真核生物中一類長度約22個核苷酸的參與基因轉錄水平調控的非編碼RNA[22]。miRNA具有調節細胞分裂周期，細胞分化、遷移等功能，參與疾病的發生發展[23]。miR25屬于miR106B-25家族簇。該家族簇包括三個成熟的miRNAs(miR106b，miR-93-和miR-25)。他們在不同類型的腫瘤中均有表達，包括胃癌、前列腺癌、肝癌和胰腺神經內分泌腫瘤。miR-106b和miR-93具有相同的種子序列。相反，miR-25與它們沒有相同的序列，預期具有單獨的細胞功能。但是在結腸癌中的研究并不多見。Petrocca等[24]報道miR-106b和miR-93抑制細胞周期抑制因子CDKN1A的表達，而miR-25 降低BCL2L11的表達。這說明miR-106b和miR-93和miR-25的作用機制明顯不同。

本研究發現結腸癌患者血漿中microRNA-25的表達明顯升高，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。徐曉慧等[25]通過檢測結腸癌組織與癌旁組織中microRNA-25的表達差異，得出microRNA-25在直腸癌及腺瘤組織中表達增高，在淋巴結轉移和臨床(TNM)分期差的病例中表達升高。但是組織中存在取材困難以及有創等缺點。因此本研究進一步證實microRNA-25作為促癌基因在結腸癌的發生發展中起到重要作用。同時本研究應用ROC曲線的繪制發現，microRNA-25作為結腸癌的生物標志物(AUC)曲線下的面積為0.906，其診斷的準確性為96.2%。曲線下的面積>0.9，說明其診斷準確性極高。

血清CEA是一種腫瘤細胞的黏附因子，動態監測CEA是臨床上常用的監測腫瘤的復發、轉移等指標有重要的臨床意義[26,27]。本研究中microRNA-25在血清CEA高表達與低表達之間差異并無統計學意義(P>0.05)。但是這并不能直接反應microRNA-25與結腸癌的侵襲無關，因進一步動態監測加上長期隨訪確定microRNA-25與腫瘤預后的關系。

近些年來發現microRNA在腫瘤的發生發展，侵襲以及遠處轉移發揮了重要作用。本研究結果顯示microRNA-25與結腸癌的腫瘤分期有關，隨著結腸癌腫瘤分期的增加，microRNA-25的表達量增加，進一步說明microRNA-25可以促進結腸癌的發生發展。人體不同組織和腫瘤細胞的miRNA表達譜在數量和豐度上具有特異的區別，細胞產生的miRNA會隨著血液的全身運行而循環至外周血中，使外周血中的miRNA也出現相應的區別。這是miRNA作為腫瘤診斷標志物的基礎。Petrocca等[28]系統綜述得出microRNA-25在胃癌、前列腺癌以及食管癌中均為高表達，并且可能通過下游不同的機制調控腫瘤的發生發展。Xu等[29]發現microRNA-25在食管鱗狀細胞癌中高表達，并且microRNA-25的高表達與淋巴結的轉移以及TNM分期有明顯相關性，作者進一步分析發現micro-RNA-25可能通過靶向CDH1促進食管鱗癌的發生發展。單獨應用miRNA的診斷敏感性提高的同時需要進一步提高診斷的特異性。這也是未來研究結腸癌標志物。

綜上所述，結腸癌的發生發展是一個復雜的過程，結腸癌外周血中microRNA-25的高表達可能參與了其發生發展過程，為結腸癌的早期篩查提供了新指標。