補腎活血法對再生障礙性貧血患者骨髓MSCs增殖及成血管功能的影響

史亞婷 劉文賓 吳迪炯 沈一平 周郁鴻 葉寶東

再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一種以全血細胞減少、骨髓造血功能衰竭為特征的血液病，其發病機制尚未明確。目前認為免疫機制異常、造血微環境改變和造血干細胞缺陷是其三大原因［1］，其中造血微環境異常在其發病中的作用越來越受到重視。作者前期研究發現AA 患者骨髓微血管密度（MVD）顯著低于正常人［2］，且重型AA 更顯著，低血管密度勢必會影響骨髓血供，對造血細胞的成熟與分化不利。而骨髓間充質干細胞（BMSCs）是骨髓微環境的重要組成部分，與造血細胞直接接觸，起到支持和營養造血細胞的作用。前期研究發現無論腎陽虛還是腎陰虛再障患者，BMSCs 的增殖能力較正常對照減弱［3］。再障的基本中醫病機為腎虛髓虧，因虛證、瘀證而發病，一定程度上與現代認識的微循環相契合［4］，同時應用補腎活血法取得較好的臨床療效［5］。本文探討補腎活血法對再生障礙性貧血患者BMSCs 增殖和成血管作用的影響，為臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 補腎活血中藥處方：太子參30g，補骨脂20g，仙靈脾20g，肉桂4g，生地15g，熟地20g，茯苓10g，菟絲子15g，制何首烏10g，丹參10g，當歸10g，赤芍9g，丹皮9g，山藥30g，均選取江陰天江藥業有限公司標準中藥顆粒劑。

1.2 實驗動物 周齡雄性SPF 級荷蘭兔，體重2~3kg，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.3 制備含藥血清及對照血清 將212g×6 包原生藥加一定量的水，用水提法濃縮成1000ml 液體。隨機將6 只兔子分成兩組，對照血清組予灌胃生理鹽水20ml/次，2 次/d，共7d；含藥血清組予每次灌胃中藥湯液20ml，2 次/d，共7d。從實驗第4 天起，每天分別對2 組兔子在第2 次灌胃2h 后耳靜脈取10ml 全血，后立即離心，每組獲得約5ml 血清。將4 次血清混合后，每組共獲得約20ml 血清，置于水浴箱中56℃，30min 滅活，0.22μm 過濾器過濾除菌，分裝至15ml 離心管中，-20℃冷藏備用。

1.4 再障患者BMSCs 的獲取 選取2018 年6 月1 日至12 月31 日本院血液內科住院的初發AA 患者8 例，其中男4 例，女4 例；中位年齡26（18~46）歲。病例診斷均符合再生障礙性貧血診斷與治療中國專家共識（2017 年版）［6］。所有患者均知情同意，簽署知情同意書。常規抽取再障患者骨髓5~10ml，采用已經建立的骨髓MSCs 提取方法［3］，采用流式細胞術鑒定MSCs，取3 ～6 代細胞進行后續研究。

1.5 主要儀器與試劑 多功能全波長酶標儀（K3），美國Thermo 公司；8μm 孔徑 transwell 裝置，Corning Coster Corp 公司。

1.6 CCK8 檢測補腎活血法對再障患者BMSCs 增殖的影響 （1）取生長狀態良好的P3 代細胞，以5×103密度接種于96 孔板中，每孔200μl。（2）無血清培養24h 后，分成12 組，分別為5%、10%、15%、20%、25%、30% 含 藥 血 清 組 和5%、10%、15%、20%、25%、30%對照血清組每組5 個復孔，培養24h、48h、72h 后， 加 入CCK8 溶 液10μl/ 孔，5% CO2，37 ℃細胞培養箱內培養4h。（3）取出96 孔板，低速震蕩15min，酶標儀570nm 波長檢測吸光度（OD）值。

1.7 Transwell 檢測補腎活血法對重型再障患者BMSCs體外遷移的影響 （1）取生長良好的P3 代BMSCs 細胞，無血清培養24h 后，分成12 組，分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%含藥血清組和對照血清組，予對應血清濃度預處理24h。（2）調整各組細胞密度為5×105/ml，在transwell 下室加入含100μg/ml SDF-1 培養液；上室分別加預處理后的各組細胞懸液200μl。置于37℃、5% CO2細胞培養箱中孵育6h。（3）取出transwell 裝置，PBS 洗滌，置于4%多聚甲醛中固定 15min。（4）PBS 洗滌3 次后，將transwell 裝置置于0.1%結晶紫溶液中染色15min。（5）棄染色液，PBS 洗滌3次，自然晾干，棉簽拭去小室上層細胞。（6）倒置相差顯微鏡觀察小室下層細胞。（7）將transwell 小室置于200μl 結晶紫脫色液中脫色30min。酶標儀570nm波長檢測脫色液吸光度（OD）值。

1.8 Western Blot 檢測誘導后細胞血管內皮細胞標志表達 （1）取生長良好的P3-P5 代再障BMSCs 予含VEGF10ug/LDMEM 培養基預處理24h。（2）分別搜集25%含藥血清和25%對照血清誘導1d、3d、5d、7d細胞于EP 管中，加入1 ∶100 混勻的含蛋白酶抑制劑和RIPA 裂解液混合液100μl，震蕩混勻，予冰上裂解1h。4℃以12000r/min 離心15min。棄上清液，加入100μl 蛋白上樣緩沖液，取少量測定蛋白濃度，繪制標準曲線，剩余蛋白予98℃水浴加熱10min，存入-80℃冰箱備用。（3）按試劑盒操作說明進行CD31、Tie-2蛋白測定。

1.9 統計學處理 采用SPSS 23.0 統計學軟件。計量資料以（±s）表示，兩組比較采用t 檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 補腎活血含藥血清對BMSCs 增殖影響 與對照血清組比較，10%和25%含藥血清培養24h，5%、15%和25%含藥血清培養48h，各濃度培養72h 對BMSCs 增殖具有明顯促進作用（P<0.05）。含藥血清對BMCs 增殖促進作用與時間呈一定依賴關系，24h 與48h 作用相似，但72h 明顯增強。與對照血清組比較，25%含藥血清濃度在各時間段的差異均有統計學意義（P<0.05），因此選擇25%含藥血清濃度為后續形態學觀察和WB 檢測血管內皮細胞標志實驗濃度，見圖1~3。

注：與對照血清組比較，*P<0.05

圖2 補腎活血含藥血清對BMSc增殖影響（48h）

圖3 補腎活血含藥血清對BMSc增殖影響（72h）

2.2 補腎活血含藥血清對BMSCs 體外遷移的影響 應用上述Transwell 裝置重復實驗5 次，結果顯示：不同濃度對照血清及含藥血清組均可見梭形結晶紫染色BMSCs，其中15%、20%、25%、30%含藥血清組較其他組細胞數較多，對照血清各濃度組相似。脫色后測得OD 值統計分析結果示：與對照血清組比較，5%、10%含藥血清OD 值相似差異無統計學意義（P>0.05），15%、20%、25%、30%含藥血清OD 值較高，差異有統計學意義（P<0.05），15%、20%、25%、30%含藥血清促進作用相似，無明顯濃度依賴關系，見圖4。

圖4 補腎活血含藥血清對BMSCs體外遷移的影響

2.3 含藥血清誘導后形態觀察 25%含藥血清誘導1d 后，BMSCs 形態未見明顯改變，仍呈長梭形生長，排列緊密，誘導7d 后細胞間距增大，排列松散，胞體呈多角形或不規則形。含藥血清誘導21d 可見少量管腔樣結構形成。25%對照血清21d 形態無改變。見圖5。

圖5 不同含藥血清誘導后BMSCs形態的變化

2.4 WB 檢測血管內皮細胞標志 25%含藥血清誘導1d 后有少量CD31、Tie-2 蛋白，后隨著時間延長，表達量逐漸增多，25%對照血清誘導7d 后未見CD31、Tie-2 蛋白表達，見圖6。

圖6 WB檢測血管內皮細胞表面標志（CD31和Tie-2）表達

3 討論

骨髓造血微環境（BMHM）是造血細胞直接的生存環境，其主要作用是為造血細胞運輸氧氣、營養成分、信號因子，同時運輸代謝廢物，是其生存和健康發育必備條件之一。骨髓微血管是BMHM 的場所，其生成受多種因子的聯合影響，取決于促血管形成因子與血管抑制因子的作用偏傾。目前已經明確AA 患者的BMHM 受損，不過尚未明確是免疫因素導致其受損還是先有BMHM 受損，或二者相互作用而導致AA 發生。前期研究發現AA 患者骨髓微血管密度（MVD）顯著低于正常人［2］，且重型AA 更顯著，低血管密度勢必會影響骨髓血供，對造血細胞的成熟與分化不利。造血細胞的增殖分化需要來自骨髓細胞自分泌及外周循環的各類因子的刺激，再障患者骨髓MVD 減少，與骨髓血管內皮生長因子（VEGF）表達減少相關［2，7］，且在免疫抑制劑或骨髓移植治療后，MVD 及VEGF 均顯著上升，但以免疫抑制劑的作用更明顯，可能與環孢菌素（CsA）直接刺激造血或非造血細胞分泌VEGF有關［8］。中藥藥理發現，活血化瘀類中藥能在一定程度上促進血管新生，故在此基礎上提出補腎固本兼以活血化瘀的基本治療方法，臨床療效亦得到提高［9-10］。相關分析顯示IL-2、IL-10、IL-4、IFN-γ 與骨髓MSCs 生成負相關，IL-6、TNF-α 呈正相關［11］，提示補腎活血法可能通過提高骨髓MSCs 粘附分子的表達水平，改善骨髓造血微環境，從而提高療效。在AA患者異基因造血干細胞移植過程中應用補腎健脾祛瘀法干預，發現補腎活血可以明顯提高移植物植入率，減少移植排斥［12］，可能也是與補腎健脾祛瘀改善患者骨髓微循環有關。

本實驗將再障BMSCs 分離并體外培養，觀察不同濃度含藥血清對再障BMSCs 增殖作用的影響，10%和25%含藥血清培養24h，5%、15%和25%含藥血清培養48h，各濃度培養72h 對BMSCs 增殖具有明顯促進作用（P<0.05）。含藥血清對BMSCs 增殖促進作用與時間呈一定依賴關系，24h 與48h 作用相似，但72h 明顯增強。與對照血清組比較，25%含藥濃度在各時間段均有意義（P<0.05）。通過體外誘導實驗發現，25%補腎活血含藥血清隨著時間的延長，能誘導BMSCs 向血管內皮細胞分化，主要體現在細胞形態的變化和管腔樣結構的形成和血管內皮細胞標志的出現。綜上，補腎活血法可能是通過促進再障患者BMSCs 的增殖以及向血管內皮細胞分化來促進骨髓微血管的生成，從而作為補腎活血法改善骨髓微環境的機制之一。

AA 歸于中醫“虛勞”、“髓勞”、“血證”等范疇，目前認為先天肝腎不足、后天勞役失養，邪毒之氣乘虛而入是其主要的病因病機。治療上主張從腎論治，臨床療效得到提高，但是有部分患者的臨床療效并不理想，且對于重型或非重型再障、急性或慢性再障，中醫藥介入的時機和療效還有比較大的爭議。對于AA，在從腎論治的基礎上，如何進一步闡明其病因病機并相應的調整療法以提高療效，值得進一步探索。