斷裂內(nèi)含肽介導(dǎo)的親和介質(zhì)與親和標(biāo)簽的應(yīng)用

杜夜星, 周挺峻, 陳浩然, 夏海鋒,2

(1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 無(wú)錫 214122； 2. 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 無(wú)錫 214122)

1 前 言

蛋白質(zhì)的表達(dá)與純化，是目前最重要的課題之一。親和標(biāo)簽的使用，簡(jiǎn)化了蛋白純化操作。但目前還沒(méi)有簡(jiǎn)單方法去除親和標(biāo)簽。將內(nèi)含肽應(yīng)用于親和層析中提供了一種解決這個(gè)問(wèn)題的方法[1]。內(nèi)含肽是位于未成熟蛋白中的一段多肽序列，可以在前體蛋白中發(fā)生自我剪接，將兩端外顯肽通過(guò)一個(gè)新形成的肽鍵連接在一起，這一過(guò)程稱為內(nèi)含肽的剪接反應(yīng)[2-5]。其剪接機(jī)制4步親核反應(yīng)組成[6-7]。由內(nèi)含肽不同的結(jié)構(gòu)特性，人為地將其分為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)含肽，微小內(nèi)含肽以及斷裂內(nèi)含肽3類[8-9]。其中，斷裂內(nèi)含肽為空間結(jié)構(gòu)上互不連續(xù)的兩段序列。在發(fā)生剪接反應(yīng)前，斷裂內(nèi)含肽2個(gè)片段需要先彼此識(shí)別組裝成完整內(nèi)含肽，然后按照標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)含肽剪接反應(yīng)完將兩端外顯肽通過(guò)一天然肽鍵連接，這一過(guò)程稱為反式剪接[10]。將斷裂內(nèi)含肽的一些特定的、起剪接活性的保守氨基酸進(jìn)行突變，則可阻止突變位點(diǎn)一端的反應(yīng)，只發(fā)生另一端的斷裂反應(yīng)，稱為N端或者C端斷裂反應(yīng)。

利用斷裂內(nèi)含肽可以將目的蛋白無(wú)標(biāo)簽純化的特點(diǎn)，使用Cfa斷裂內(nèi)含肽 (Consensus fast DnaE intein) 構(gòu)建了一種新型的親和層析介質(zhì)，來(lái)分離純化蛋白[11]。Cfa 斷裂內(nèi)含肽與Npu 斷裂內(nèi)含肽 (Nostoc punctiorme DnaE intein) 的序列有著高度相似性(82%)，N片段中含有101個(gè)氨基酸；C端片段較小，僅有25個(gè)氨基酸。……