補陽還五湯通過notch信號通路增強神經干細胞移植對腦缺血/再灌注大鼠的腦保護作用

張紫微，翟 羽，張 怡，靳曉飛，董賢慧，高維娟

(河北中醫學院，河北省心腦血管病中醫藥防治研究重點實驗室，河北 石家莊 050091)

缺血性腦卒中是當今常見的高危疾病之一，因缺血后易造成永久性的損傷，且臨床治療手段有限，難以恢復死亡的神經元，所以具有預后不佳、致死、致殘率高的特點[1]。近年研究發現神經細胞受損后可以通過神經干細胞(neural stem cells，NSCs)移植來彌補或拯救神經元[2]，成為缺血性腦卒中的新型治療候選者[3]。Notch信號通路能夠調控細胞分化、增殖、凋亡、遷移和血管生成，在決定細胞命運中具有核心作用[4]。研究發現，激活狀態下的Notch信號通路主要通過調節下游效應分子Hes1和Hes5來調控NSCs的增殖和分化[5]。補陽還五湯是王清任《醫林改錯》中的經典方劑，在臨床中被廣泛用于治療缺血性腦卒中。補陽還五湯對神經干細胞移植后腦缺血/再灌注大鼠的神經保護作用是本課題組的前期研究結果，并且Notch信號通路抑制劑可以通過影響該通路促進腦缺血/再灌注大鼠NSCs移植后的神經再生。但是，補陽還五湯對腦缺血/再灌注大鼠NSCs移植后的腦保護作用是否是通過調控Notch信號通路起作用的，鮮有報導。因此，本研究以腦缺血/再灌注大鼠模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)為研究對象，探討補陽還五湯是否通過調控Notch信號通路增強神經干細胞移植對腦缺血/再灌注大鼠的腦保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD大鼠80只，♂，清潔級，自北京維通利華公司購買，體質量均在(275±2) g。公司生產許可證號為：SCXK(京)2016-0011。

1.2 試劑及藥品戊巴比妥鈉購于北京化學試劑公司(批號020402)；培養基的組成包括購于Gibco公司的DMEM/F-12(1 ∶ 1)(批號8119014)、B-27(批號1865349)和購于PeproTech公司的堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)(批號1210432-1)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)(批號1009390)；Notch1(批號5)、Hes1(批號3)抗體購于CST公司，Hes5抗體購于Abcam公司(批號GR214854-7)。DAPI染液(批號180118)、Nestin兔抗大鼠單克隆抗體(批號AF12261998)、Actin抗體(批號LS190312)、以及其他分析純試劑均購于賽維爾有限公司。補陽還五湯由黃芪120 g，赤芍5 g，當歸尾6 g，紅花3 g，地龍3 g，桃仁3 g，川芎3 g組成，藥材購自河北樂仁堂藥業有限公司，煎藥濃縮至100 mL(1 mL約含1.43 g生藥)。

1.3 主要儀器超凈工作臺SW-CJ-2FD型、Heal Force二氧化碳培養箱HF240型、Stoelting全自動腦立體定位儀51700型；Leica包埋機EG11508、輪轉切片機RM2255、生物顯微鏡DMI3000B、光學顯微鏡DM5000B型；Eppendorf離心機；UVP凝膠成像機；Bio-Rad電泳儀、半干轉膜儀。

1.4 提取、培養及鑒定NSCs[6]培養基由DMEM/F-12、B27、EGF、bFGF、配置而成。取購自維通利華公司的孕14 d大鼠，麻醉并酒精消毒后，剝出子宮，在超凈臺內取胎鼠大腦皮質，用眼科剪剪碎后，用手動吹打法使較大的組織變化為細胞懸濁液，并在吹打后使用細胞篩濾過以保證懸液均勻。離心5 min后取出，速率為1 000 r·min-1，傾倒上清液后加培養基，再次吹打懸浮，接種在25 cm2培養瓶，培養于CO2培養箱，密度1.0×109·L-1，恒溫37 ℃。在放有多聚賴氨酸包被蓋玻片的6孔板中接種已傳至第3代的細胞懸液，4 h后顯微鏡下觀察到神經球已粘附于蓋玻片，貼孔板側壁輕柔吸去多余懸液，并用體積分數0.04多聚甲醛固定，15 min后PBS輕柔沖洗3次，每次5 min(后續PBS沖洗均為3次，每次5 min)；室溫下質量濃度3 g·L-1TritionX-100孵育，20 min后PBS沖洗；室溫下山羊血清封閉，30 min后PBS沖洗。之后滴加Nestin抗體(1 ∶ 200)，在4 ℃環境中孵育，過夜后在室溫避光環境下加入二抗(FITC)孵育，1 h后PBS沖洗；滴加DAPI染液孵育，10 min后PBS沖洗；取片加抗熒光淬滅封片劑進行封片，并檢測Nestin的表達。

1.5 模型制作及評價大鼠在造左側MCAO模型前禁食水，術前麻醉使用質量濃度為40 g·L-1的戊巴比妥鈉(1 mL·kg-1)根據重量計算后腹腔注射，操作臺上固定、消毒、備皮。頸總、頸內和頸外動脈在頸部正中切開2 cm后，分離暴露；結扎3次頸外動脈后在前中結扎點間做一切口，用合適的線栓斜行插入，將頸總、頸內動脈用血管夾夾閉，剪斷頸外動脈于后側結扎點前，借助中部結扎線使頸外離斷端與頸內動脈入顱方向一致，松頸內血管夾，插線栓至大腦中動脈,稍有阻力感后停止，線栓進入約(19±1) mm。2 h后拔栓并系死前側結扎點,碘伏消毒，依次縫合切口,術后動物給與保暖至蘇醒[7]。術后24 h，做神經功能評分確定模型是否成功，按Zea Longa 5分制處理：行為無改變為0分；右前爪無法舒展為1分；向右側行走轉圈為2分；行走向右側歪倒為3分；喪失自發活動與意識為4分。0分、4分動物死亡為模型失敗，不予選取，將1～3分大鼠納入實驗對象。

1.6 分組及給藥實驗分組為假手術組(Sham)、模型組(Model)、補陽還五湯組(BYHWT)、移植組(Transplant)、補陽還五湯+移植組(BYHWT+Transplant)，每組各16只；其中假手術組只分離血管，其余4組隨機平均分配64只模型成功大鼠。BYHWT組與BYHWT+Transplant組于手術麻醉清醒2 h后，灌胃給予補陽還五湯，給藥劑量為14.8 g·kg-1·d-1，每日灌藥量分兩次給予，連續灌胃14 d，其余3組給予等體積蒸餾水。各組大鼠于NSCs移植后第14 d進行取材。

1.7 NSCs移植[8]模型制作24 h后進行NSCs移植，麻醉消毒，固定大鼠于腦立體定位儀上,以前囟為坐標零點定位:AP=0.36 mm,ML=3.15 mm,DV=5.5 mm,微量注射器注射速度:1 μL·min-1，細胞濃度為1.0×106·L-1，注入NSCs 10 μL于大鼠左側紋狀體區，完畢后留針10 min拔針，消毒縫合。

1.8 TTC染色檢測大鼠迅速斷頭取腦，在置于質量濃度20 g·L-1的TTC染液前，放在-20 ℃環境15 min,并于取出后的腦槽內做5片，2 mm厚冠狀切片；37 ℃恒溫箱中避光孵育,10 min后翻面1次,20 min后在體積分數0.04的多聚甲醛中固定。24 h后拍照，腦梗死體積圖片的分析使用Image-Pro Plus 6.0軟件。

1.9 HE染色觀察梗死區腦組織細胞體積分數為0.04的多聚甲醛灌注取腦，腦組織石蠟包埋，做冠狀切片，厚5 μm。60 ℃烘烤石蠟切片2 h后，依次于二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ中脫蠟 ，每次15 min，然后于梯度乙醇脫水，每次5 min，依次為體積分數1的乙醇Ⅰ、Ⅱ和體積分數0.8的乙醇；蒸餾水復水、蘇木素染液染色各5 min，流動水輕洗數秒，分化3 s，水洗反藍少于30 s，過洗2 s，伊紅染液浸染1～3 min，蒸餾水輕洗1～2 s；再次梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理，樹膠封片，鏡下拍照，進行細胞計數，并觀察腦組織神經細胞損傷情況。

1.10 Western blot法檢測各組大鼠快速在冰上斷頭，取缺血側腦組織；稱重后，加入裂解液勻漿，取上清(組織總蛋白)。BCA法進行蛋白濃度測定。加樣后，用SDS-PAGE凝膠電泳，傳至PVDF膜；室溫下，質量濃度50 g·L-1脫脂奶粉封閉，2 h后分別加入兔抗大鼠Actin(1 ∶ 2 000)、Notch1、Hes1、Hes5(1 ∶ 1 000)抗體，4 ℃孵育過夜；室溫下加入二抗(1 ∶ 2 000)孵育，1 h后洗膜，避光并滴加ECL顯影，于化學發光成像系統觀察。以β-actin作內參照，以目的條帶灰度值與內參照條帶灰度值之比分析蛋白質的相對表達。

2 結果

2.1 神經干細胞的證明如Fig 1所示，在倒置顯微鏡下對培養6 d的新生大鼠腦組織原代細胞進行觀察，觀察發現:視野中存在多個懸浮、規則、無突起的桑葚狀致密細胞球和大量單細胞。免疫熒光染色檢測結果顯示:具有熒光特性的FITC標記的Nestin發出綠色熒光；細胞核被DAPI核染，發出藍色熒光，表明Nestin表達呈陽性，提示培養的細胞為NSCs。

2.2 神經功能學評分比較如Fig 2，Sham組為0分。Model組較Sham組評分增加(P<0.05)；BYHWT組、Transplant組和BYHWT+Transplant組較Model組評分均降低(P<0.05)；BYHWT+Transplant組較Transplant組評分進一步降低(P<0.05)。

Fig 1 Immunofluorescence identification of neural stem cells

A: 6 d neural stem cells; B: Positive cells were stained with nestin immunofluorescence; C: DAPI; D.Merge

Fig 2 Neurological score of each group

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vstransplant group.

2.3 腦梗死體積比較如Fig 3所示，Sham組無白色梗死灶形成。與Sham組比較，Model組缺血側梗死區體積較大(P<0.05)； BYHWT組、Transplant組和BYHWT+Transplant組較Model組相比，梗死體積均縮小(P<0.05)；BYHWT+Transplant組較Transplant組梗死體積進一步縮小(P<0.05)。

2.4 缺血側腦組織HE染色比較如Fig 4所示，Sham組大鼠腦組織神經細胞大小形態基本一致，分布均勻、致密，結構正常，胞質充盈，核仁清晰，未見空泡狀水腫和變性，未見明顯核固縮與核溶解；與Sham組比較，Model組大鼠腦組織大量細胞受損嚴重，分布稀疏，出現較多空泡狀水腫、變性，以及核固縮和核溶解，皺縮細胞核數量增多(P<0.05)；BYHWT組、Transplant組和BYHWT+Transplant組分別與Model組比較，細胞狀態表現出不同程度的減輕，核收縮和溶解的細胞數有一定程度的降低(P<0.05)；BYHWT+Transplant組較Transplant組損傷程度進一步減輕(P<0.05)。

Fig 3 TTC staining results of each group

2.5 各組Notch1、Hes1、Hes5蛋白表達如Fig 5所示，Sham組 Notch1、Hes1、Hes5蛋白均有一定量的表達，與Sham組比較，Model組Notch1、Hes1、Hes5蛋白表達水平均上調(P<0.05)；BYHWT組、Transplant組、BYHWT+Transplant組較Model組，各項蛋白表達均有所上調(P<0.05)；BYHWT+Transplant組較Transplant組各項表達上調(P<0.05)。

3 討論

缺血性腦卒中的治療是當今備受關注和亟待解決的關鍵問題，如何有效緩解腦損傷成為治療的首要關注點。腦損傷的修復受到多種因素的調控，其中通過經典的Notch信號通路調節NSCs的增殖和分化被多數研究認可[9]。Notch通路受體蛋白(Notch1～4)激活后與相鄰配體結合，經過多次介導啟動下游堿性螺旋-環-螺旋基因：Hes1和Hes5效應分子轉錄。研究證明，機體調控NSCs的增殖、分化與Notch1、Hes1和Hes5的活化密切相關。NSCs細胞周期的退出以及過早分化與Notch1受體表達減弱有關；Hes1與抑制NSCs分化有關；而Hes5可以促進NSCs的增殖，它們共同參與維持神經細胞數量與種類的穩定[10]。

Fig 4 HE staining of brain tissues in each group of rats (Bar=100 μm)

腦卒中屬于中醫中風病的范疇，缺血性腦卒中的主要病機為氣虛血瘀。針對病機治療的補陽還五湯在長期臨床實踐中證明療效卓越。現代醫學研究發現補陽還五湯可以從抑制神經細胞凋亡、抑制細胞毒性、抑制炎癥介質等方面負向調控；也可以從促進NSCs增殖分化、促進相關生長蛋白表達、促進信號通路激活等多個方面正向調控，共同發揮對神經細胞的保護作用[11]。

Fig 5 Western blot results

本研究結果顯示在腦缺血/再灌注損傷發生后，MCAO大鼠腦組織Notch1、Hes1、Hes5表達顯著升高，表明機體內源性激活Notch1、Hes1、Hes5，參與修復受損部位，與涂建鋒等[12]的研究結果一致。單純進行補陽還五湯與單純進行外源性NSCs移植治療14 d后，Notch1、Hes1、Hes5表達增加，腦組織細胞與神經功能有所恢復，說明Notch信號通路被激活并對腦缺血/再灌注損傷有保護作用[13-14]。然而前期研究結果顯示，外源性NSCs移植治療7 d后Notch相關蛋白表達減少，神經保護作用與Notch通路促進外源性NSCs的分化有關[8]，結合本實驗我們猜測NSCs移植對Notch信號通路的影響可能是動態的，結果的差異性可能是因為NSCs移植在抑制Notch通路而促進外源性NSCs分化的同時，還參與了腦組織內環境與炎癥反應的改變[15]，故表現為前期外源性NSCs分化程度較內源性NSCs增殖程度明顯，但是隨著時間的增加，外源性NSCs分化逐漸穩定，炎癥反應降低，內環境相對穩定，使Notch信號通路被激活，促進內源性NSCs增殖。隨后我們研究腦缺血/再灌注損傷的修復作用是否能在NSCs移植與補陽還五湯的共同作用下，通過調控Notch信號通路而提高。研究結果證實：BYHWT+Transplant組各項蛋白明顯上調，腦組織與細胞的恢復明顯優于Transplant組。由此我們認為補陽還五湯可能是通過上調Notch信號通路，為移植后的內源性NSCs長期保持增殖水平提供了保障，提高了內源性NSCs增殖的潛能，彌補了移植后快速分化帶來的治療短暫性，從而增加了NSCs移植對腦缺血/再灌注損傷治療的持續性，并發揮更持久的腦保護作用。