順鉑聯合小檗堿通過誘導DNA損傷和ROS依賴性凋亡抑制肺癌細胞A549的生長

毛娟娟，程偉松，楊亦德，金 茜，汪佳兵

(臺州市立醫院 1.感染科、2.泌尿外科、3.藥劑科，浙江 臺州 318000)

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居惡性腫瘤之首。由于早期缺乏常規檢查，多數患者被確診時已處于中晚期階段，很難通過手術完全根治[1]。經典的細胞毒性藥物仍然是臨床上治療肺癌的主要選擇。在這一系列的細胞毒性藥物中，順鉑為代表的鉑類藥物是常見的化學治療藥物[2]。順鉑是目前臨床上治療肺癌的一線化學治療藥物，能夠誘導DNA損傷，抑制肺癌細胞生長[3]。然而，順鉑會損害正常細胞，導致嚴重的副作用，從而限制了其臨床療效[3]。為了降低順鉑的副作用，腫瘤學家根據經驗開發了聯合化療方案。小檗堿(berberine，BBR)是從中藥黃連根莖中提取的一種異喹啉類生物堿，研究發現BBR具有抗微生物和抗炎等多種藥理活性[4]。目前，研究表明BBR對肝癌、前列腺癌、膠質細胞瘤、卵巢癌、白血病和乳腺癌等表現抗腫瘤作用[5]。目前BBR對肺癌的研究有部分報道，但順鉑聯合BBR對肺癌的抗腫瘤作用和機制尚無報道。因此，本文主要研究順鉑聯合BBR體外對肺癌A549細胞增殖、凋亡的影響，并探討其可能存在的抗肺癌作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人肺癌A549細胞，購自于上海中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

1.1.2藥物與試劑 順鉑(貨號：P4394，Sigma公司)；小檗堿和N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)(貨號：B107342和A105422，上海阿拉丁有限公司)；MTT、結晶紫、Triton X-100、多聚甲醛、DCFH-DA和DAPI(上海碧云天生物技術有限公司)；PBS緩沖液、0.25%胰蛋白酶(含EDTA)和0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)和胎牛血清(Gibico公司)；AnnexinV binding buffer、FITC AnnexinV Apoptosis及PI染色液(BD Biosciences Clontech)；γH2AX、Bcl-2、caspase-3、cleaved-caspase-3和GAPDH(Cell Signaling Technology)。

1.1.3儀器 Spectra Max M2多功能酶標儀(Molecular Device公司)；CO2培養箱(Thermo美國熱電集團)；倒置顯微鏡(日本尼康公司)；低溫高速離心機(Thermo美國熱電集團)；凝膠成像系統(Bio-Rad公司); 細胞流式儀(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 人肺癌A549細胞用含90% RPMI 1640培養基，10%胎牛血清，100 U·mL-1鏈霉素和100 U·mL-1青霉素培養。所有進行實驗的細胞復蘇后傳代應少于20代，且置于37 ℃、5% CO2的恒溫二氧化碳細胞培養箱中。

1.2.2MTT檢測A549細胞活力情況 取100 μL對數生長期A549細胞接種于96孔板(細胞數約每孔8 000個)，置于37 ℃細胞培養箱中培養過夜，以讓細胞貼壁。次日更換新鮮培養基，加入不同濃度的BBR(0、3、6、12、25、100、200 μmol·L-1)， BBR(8 μmol·L-1)與不同濃度的順鉑(0、2.5、5、7.5、10、15 μmol·L-1)，并且設置DMSO為陰性對照組。24 h后每孔加20 μL MTT。4 h后每孔再加150 μL DMSO，酶標儀波長設置為490 nm測得OD值。生存率/%=給藥組OD/陰性對照組OD值×100%。

1.2.3細胞集落實驗檢測A549集落形成情況 取對數生長期A549細胞1 mL分別接種到6孔板中，每孔含5×105個細胞，放入細胞培養箱中培養過夜。次日更換新鮮培養基，設置對照組、BBR(8 μmol·L-1)組、順鉑(10 μmol·L-1)組和(BBR+順鉑)組。用正常培養基培養細胞約8 d。用PBS清洗2次，用4%多聚甲醛固定細胞30 min，加入結晶紫染色液，用PBS清洗5次，并用相機拍照獲得圖像。

1.2.4流式細胞儀檢測A549細胞凋亡情況 取對數生長期A549細胞，1 mL接種到6孔板中，每孔含5×105個細胞，放入細胞培養箱中培養過夜。次日更換新鮮培養基，設置對照組、BBR(8 μmol·L-1)組、順鉑(10 μmol·L-1)組和(BBR+順鉑)組。加NAC組(5 mmol·L-1)需要提前孵育1 h再加藥，六孔板置37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養24 h。收集細胞上清液，用PBS洗1次，用0.5 mL胰蛋白酶(不含EDTA)消化細胞，1 100 r·min-1離心4 min，棄上清用1 mL PBS重懸細胞，洗滌，1 100 r·min-1離心4 min，棄上清用 Binding buffer重懸細胞，加入至流式管中。每個流式管避光加入Annexin V，染色10 min后，再加PI染色5 min，然后加入Binding Buffer，最后用流式細胞儀進行收集檢測。

1.2.5免疫熒光檢測A549細胞DNA損傷情況 取對數生長期A549細胞，將每孔約1×105個細胞置于免疫熒光小皿中至細胞貼壁，棄去舊培養液，設置對照組、BBR(8 μmol·L-1)組、順鉑(10 μmol·L-1)組和(BBR+順鉑)組，作用時間為12 h。用預冷PBS洗3次，每次3 min；用4%的多聚甲醛固定細胞10 min，PBS洗3次，每次3 min；0.5% Triton X-100室溫通透10 min，PBS洗3次，每次3 min；在小皿中滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；棄封閉液，不洗，每個小皿滴加足夠量一抗并放入濕盒，4 ℃孵育過夜； PBST洗3次，每次3 min；加熒光二抗濕盒中室溫孵育1 h，PBST洗3次，每次3 min；滴加DAPI避光孵育5 min，對細胞進行染核，PBST洗3次，每次3 min；加入抗熒光猝滅劑，倒置熒光顯微鏡拍照。

1.2.6流式細胞儀檢測A549細胞內ROS情況 取對數生長期A549細胞1 mL，含5×105個細胞，分別接種到6孔板中，放入細胞培養箱中培養過夜。次日更換新鮮培養基，設置對照組、BBR(8 μmol·L-1)組、順鉑(10 μmol·L-1)組和(BBR+順鉑)組。棄上清培養基，用PBS洗1次，用饑餓培養基比例為1 ∶ 2 000稀釋加入DCFH-DA熒光探針，在細胞培養箱中孵育30 min，吸掉探針染色液，PBS洗滌，胰酶消化，加入培養基收集細胞。1 100 r·min-1離心3 min，棄上清用 PBS重懸細胞，1 100 r·min-1離心3 min，吸掉離心后液體，再加入PBS重懸。最后用流式細胞儀進行收集檢測。

1.2.7Western blot法檢測A549細胞內相關蛋白表達 取對數生長期A549細胞1 mL，含5×105個細胞，分別接種到6孔板中，放入細胞培養箱中培養過夜。次日更換新鮮培養基，設置對照組、BBR(8 μmol·L-1)組、順鉑(10 μmol·L-1)組和(BBR+順鉑)組。棄上清液，加入PBS洗滌，加入細胞裂解緩沖液，搖勻后放在冰上裂解5 min，用蛋白刮刀刮取蛋白混懸液并收集在預冷的EP管中。4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min,測定蛋白濃度，制蛋白樣品。取蛋白，凝膠電泳，轉膜90 min。用5 %牛奶封閉1.5 h；用0.1% TBST洗膜3次，加入適當比例稀釋的一抗，4 ℃搖床過夜；用0.1% TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫搖床孵1 h；用0.1% TBST洗膜3次，在ECL孵育顯影凝膠成像系統中成像。

2 結果

2.1 順鉑聯合BBR增強抑制A549細胞增殖如Fig 1A所示，相對于對照組，BBR能夠濃度依賴性地抑制A549生長(P<0.01)。同時，我們發現當8 μmol·L-1的BBR與不同濃度的順鉑聯合后也呈濃度依賴性地抑制細胞生長(P<0.01)。其中，進一步實驗表明，BBR(8 μmol·L-1)與10 μmol·L-1的順鉑聯用可顯著提高細胞毒性，細胞抑制率達到80%(Fig 1B)。因此，選擇8 μmol·L-1的BBR與10 μmol·L-1順鉑作為A549細胞聯合作用的濃度。

2.2 順鉑聯合BBR增強抑制A549細胞集落形成細胞集落實驗發現，相對于對照組和單藥組，聯合組能有效抑制A549細胞集落的形成(P<0.01)(Fig 2)。

2.3 順鉑聯合BBR增強誘導A549細胞凋亡流式細胞術實驗發現，相對于對照組，8 μmol·L-1的BBR和10 μmol·L-1順鉑均能誘導A549細胞凋亡，其中凋亡率分別為25.2%和15.2%。但當兩藥聯合作用后，能明顯提高A549細胞的凋亡，凋亡率達到41.2%(P<0.01)(Fig 3A，3B)。為了進一步說明聯合后對細胞凋亡的影響，Wwestern blot檢測Bcl-2和cleaved-caspase-3的表達。結果表明，相對于單藥組，聯合作用后能明顯抑制Bcl-2的表達和提高cleaved-caspase-3的表達(Fig 3C,3D)。

Fig 1 Effect of cispaltin combined with BBR on

**P<0.01vscontrol group

2.4 順鉑聯合BBR增強誘導A549細胞的DNA損傷為進一步說明兩藥聯合后的抗腫瘤機制，本實驗對誘導DNA損傷進行研究。結果如Fig 4A，4B，相對于對照組和單藥組，聯合作用后能明顯提高γH2AX蛋白的表達(P<0.01)。同時，相應的免疫熒光實驗也發現，順鉑和BBR聯合作用后，能夠明顯提高γH2AX聚焦，見Fig 4C。

2.5 順鉑聯合BBR增強A549細胞內ROS水平流式細胞術實驗進一步發現，如Fig 5A,5B，相對于對照組和單藥組，兩藥聯合作用后能明顯提高細胞內的ROS水平(P<0.01)。

2.6 順鉑聯合BBR升高ROS促進A549細胞凋亡為了說明聯合用藥后升高的ROS能夠增強A549細胞凋亡，細胞流式術實驗發現，相對于對照組和單藥組，順鉑聯合BBR明顯提高細胞凋亡率。但當兩藥聯合ROS清除劑NAC后，細胞的凋亡率明顯下降(P<0.01)(Fig 6A,6B)。并且，Western blot實驗也表明，相對于聯合組，使用NAC能夠提高Bcl-2的表達和降低cleaved-caspase-3的表達，說明了ROS介導順鉑聯合BBR的抗腫瘤作用(Fig 6C，6D)。

**P<0.01vscontrol group

3 討論

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居惡性腫瘤之首，全球范圍內，肺癌發生率不斷上升，危害日益嚴重，給人們的健康帶來了越來越多的壓力[1]。由于缺乏有效的早期診斷方法和明顯的早期癥狀，大多數肺癌患者被確診時已經處于晚期，不能通過手術切除等手段治療，化療是他們最主要的臨床治療策略[1]。目前隨著各種癌癥特異性分子生物標志物的發現，針對腫瘤特異性靶點的個體化治療逐漸成為肺癌藥物的開發熱點[5]。但靶向治療過程中不僅頻繁出現耐藥性，而且靶向藥物的治療費用昂貴，這導致了靶向治療的受限[6-7]。另外，對于一些沒有潛在可行的分子靶點的肺癌患者，靶向藥物也不能用于治療[8-9]。因此，經典的細胞毒性藥物已經成為靶向治療受限及無效患者的首選。然而，細胞毒性藥物如順鉑具有胃腸道反應、肝功能不全、腎衰竭、心血管并發癥等不良反應[3]。因此，為了降低細胞毒性藥物的副作用，聯合用藥是目前研究的熱點。

在本文中，我們探討順鉑和BBR聯合后對人肺癌A549細胞的抗腫瘤作用及相應的抗腫瘤機制。我們初步使用MTT實驗研究聯合用藥對A549細胞生存率的影響。結果表明，聯用相對較低劑量的BBR和順鉑可增強對A549細胞的細胞毒性作用。細胞集落形成實驗發現聯合能有效降低A549細胞集落的形成。細胞凋亡是基因介導的程序性細胞死亡方式之一，對于消除各種生物系統中的有害細胞至關重要，并且是細胞毒性藥物的關鍵抗腫瘤機制[10]。我們的研究表明，相對于對照組和單藥組，順鉑和BBR聯合后能有效地誘導A549細胞凋亡。Bcl-2和caspase-3被公認是在腫瘤發生中起重要作用的凋亡相關基因。本研究的Western blot結果表明，相對于單藥組，兩藥聯合能夠明顯抑制Bcl-2的表達，同時提高cle-caspase3的表達，說明順鉑聯合BBR后通過增強相關凋亡蛋白的表達起到協同作用。

研究表明，順鉑是細胞周期非特異性藥物，能夠誘導DNA損傷從而促進腫瘤細胞死亡。同時，相關報道發現，BBR也能夠直接與DNA結合后干擾DNA復制，從而誘導細胞死亡[11]，因此，BBR聯合順鉑可能通過增強DNA損傷，從而促進A549細胞死亡。γH2AX是DNA雙鏈斷裂的標記物，在識別細胞內DNA損傷、保持相關基因組的完整性和穩定中發揮著至關重要的作用[12]。本文研究表明，BBR與順鉑聯合能夠增強γH2AX蛋白的表達，免疫熒光實驗也發現聯合組的γH2AX熒光亮度增強。以上結果說明。BBR能夠增強順鉑對A549細胞內DNA的損傷，這或許是BBR增敏順鉑抗腫瘤的機制之一。

**P<0.01vscontrol group

研究發現，氧化應激與癌癥的發生和發展密切有關[13]。其中，高水平的ROS能夠損傷脂質、蛋白質和DNA，最終導致腫瘤細胞死亡[13]。同時，腫瘤細胞內ROS的水平明顯高于正常細胞，這使得腫瘤細胞更加依賴抗氧化系統來維持自身的氧化平衡狀態，也使得腫瘤細胞對ROS的上升更為敏感，故通過升高腫瘤細胞內ROS的水平能夠在對正常細胞損傷較小的情況下，選擇性殺傷腫瘤細胞[14]。本研究發現，順鉑和BBR聯用后明顯提高A549細胞內ROS水平。這與Youn等[15]報道順鉑和BBR聯用后提高Hela細胞內ROS水平結果一致。我們也發現在聯合使用NAC后，ROS被明顯降低。相應的細胞流式實驗也表明，在使用NAC后，順鉑和BBR聯用后A549細胞的凋亡率明顯降低。Western blot實驗也發現，相對于聯合組，使用NAC能夠有效提高Bcl-2的表達和降低cleaved-caspase-3的表達，以上結果都說明了ROS參與順鉑聯合BBR的抗腫瘤作用。

綜上所述，本研究表明，順鉑和BBR聯合后協同抑制A549細胞的生長，此作用主要與增強細胞凋亡、誘導細胞內DNA損傷和提高細胞內的ROS水平有關。但目前本文主要在細胞層面上研究順鉑和BBR的聯合抗肺癌作用，需要進一步在動物實驗探索順鉑和BBR聯合的抗腫瘤作用和機制。

**P<0.01vscontrol group

Fig 5 Effect of cispaltin combined with BBR on ROS formation of A549 **P<0.01 vs control group

**P<0.001vscontrol group;##P<0.01vscispaltin+BBR group