空間立構pH敏感喜樹堿新型納米膠束藥動學研究

徐文霞，趙 科，劉 源，孫文霞，任 靜

(四川省藥物制劑及裝備工程技術研究中心，四川抗菌素工業研究所，成都大學，成都 610052)

喜樹堿(camptothecin，CPT)是S-期型抗癌藥物，臨床具有顯著的抗癌活性[1,2]。但天然喜樹堿內酯環不穩定，具有例如血尿、尿頻、腹瀉等嚴重的不良反應[3,4]，限制了其臨床使用。聚乳酸作為一種天然高分子材料，具有良好的生物降解性能和優良的生物相容性；而空間立構復合物是一種由兩個互補的有規立構聚合物之間的立體選擇性相互作用而形成的復合物，它與其母體對映物相比有著穩定性更好的顯著優點。聚合物膠束具有特殊的核-殼結構(疏水嵌段為內核，親水嵌段為外殼)，其內核載藥，增溶難溶性藥物；而外殼可避免膠束被體內網狀內皮系統( reticulo-endothelial system，RES) 識別和攝取，延長藥物在體內的循環時間，并保持其穩定[5]。因此，聚乳酸空間立構復合物作為藥物載體具有獨特的物理化學穩定性，在藥物傳輸領域有著極大的應用潛力[6-8]。本實驗室前期已制備得到聚乳酸空間立構復合物為載體的喜樹堿新型納米膠束(camptothecin nanomicelles， CPT-NC)，體外質量評價良好，現分別采用大鼠及小鼠對其體內過程進行進一步的研究和評價，以為制劑產品開發奠定生物藥劑學基礎。

1 材料與方法

1.1 動物SD大鼠20只(雌雄各半，SPF級，200～250 g)，昆明種小鼠24只(雌雄各半，SPF級，25～30 g)，均由成都中醫藥大學實驗動物研究中心提供，合格證號：SYXK(川) 2015-030。

1.2 藥品與試劑CPT對照品，含量>98%，批號：drk-0333-920417，購自成都德銳可生物科技有限公司；CPT原料藥，含量98%，批號：C-12246，購自天津希恩思生化科技有限公司；鹽酸伊立替康(內標)對照品，含量 98%，批號：C023D130909，購自四川協力制藥有限公司；CPT-NC，自制。生理鹽水，含量0.9%，購自四川科倫藥業股份有限公司；甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器LC-10A高效液相色譜儀，日本島津公司產品；BSA224S萬分之一電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司產品；BP-211D電子分析天平，德國Sartorius公司產品；Allrgra X-30系列離心機，貝克曼庫爾特商貿(中國有限公司)產品；XW-80A旋渦混合器，上海精科實業有限公司產品。

1.4 溶液配制

1.4.1對照品溶液 稱取CPT對照品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解，超聲波振蕩20 min，至樣品完全溶解，甲醇定容得200 mg·L-1CPT儲備液；取儲備液適量用甲醇稀釋得到濃度為50、25、5、2.5、0.5、0.25、0.05 mg·L-1的內酯型CPT對照品系列工作溶液。

1.4.2內標溶液 稱取鹽酸伊立替康對照品適量，用甲醇配制成濃度為20 mg·L-1的溶液作為內標溶液。

1.4.3CPT混懸型注射液(CPT-Free) 取CPT適量，用少量聚氧乙烯蓖麻油和乙醇(體積比為1 ∶ 1)溶解，然后保存在-20 ℃的冰箱中備用，注射前直接用生理鹽水稀釋即可。

1.5 藥動學給藥方案及血樣本采集20只SD大鼠，雌雄各半，隨機分成4組(編號A，B，C，D)，每組5只。A、B、C組給予CPT-NC，給藥劑量分別為0.25、0.5、1mg·kg-1；D組給予CPT-Free，給藥劑量為0.5 mg·kg-1。CPT-NC與CPT-Free使用前均用生理鹽水稀釋至使用濃度，尾靜脈注射給藥。給藥前禁食12 h，給藥后繼續禁食24 h，全程不禁水，分別于給藥前以及給藥后5、15、30 min，以及1、2、4、8、12、24 h眼眶取血0.5 mL，置肝素化離心管中，8 000 r·min-1離心5 min，分離血漿置-20 ℃冰箱中保存待測。

1.6 組織分布給藥方案及樣本采集選取雌雄各半共24只小鼠，并隨機分成2組，尾靜脈注射CPT-NC或 CPT-Free，給藥劑量0.8 mg·kg-1，給藥后分別于0.5、1、4、12 h(每組每個點3只)進行眼眶取血，小鼠處死后取出心、肝、脾、肺和腎，并用生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸干，稱重，以3倍量的生理鹽水混合勻漿。血漿樣品與組織勻漿液置-20 ℃冰箱中保存待測。

1.7 測定條件與樣本處理

1.7.1色譜條件 色譜柱：HypersiL BDS-C18 (5 μm，200 mm×4.6 mm)；流動相：乙腈 ∶ 磷酸鹽緩沖液(pH 5.0)= 29 ∶ 71；流速：1 mL·min-1；檢測波長：254 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

1.7.2血漿樣品處理 取血漿樣品100 μL，同時加入內標溶液20 μL、甲醇20 μL、乙酸乙酯300 μL，渦旋混合1 min；然后12 000 r·min-1離心5 min，取上清液空氣流揮干后加入100 μL甲醇復溶，渦旋混合1 min后再12 000 r·min-1離心5 min，取上清液20 μL注入色譜儀，記錄色譜峰，以內標法按隨行標準曲線測定血漿樣品的濃度。

1.7.3組織樣品處理 組織樣品處理方式同“1.7.2”項。

1.8 方法學考察

1.8.1專屬性 在“2.4”色譜條件下，分別將空白血漿(空白組織)、加入對照品溶液和內標物的模擬血漿樣品(組織樣品)和血漿樣品(組織樣品)處理后進樣檢測，記錄色譜圖觀察內源性雜質的色譜峰對內標物和內酯型CPT的色譜峰測定是否有干擾，驗證其專屬性。

1.8.2標準曲線與定量限 取大鼠空白血漿100 μL，加入不同質量濃度的內酯型CPT對照品工作溶液20 μL，配制成含CPT 0.05、0.1、0.5、1、5、10 mg·L-1的模擬血漿樣品；同法取小鼠空白生物樣品配制成含CPT 0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 mg·L-1的模擬血漿樣品。按照“2.4”項下方法處理，以CPT與內標峰面積比值為縱坐標(Y)，CPT濃度為橫坐標(X)，采用加權最小二乘法進行回歸運算。定量限確定采用信噪比法，制備系列濃度的生物樣品，HPLC進樣測定峰面積，計算樣品信號強度(S)與基線噪音強度(N)的比例，以S/N=10時的最低樣品濃度作為定量限。

1.8.3精密度與方法回收率 取大鼠空白血漿，制成含CPT 0.05、0.1、1、5 mg·L-1的質控樣品(QC樣品)各5份；取小鼠空白血漿，制成含CPT 0.01、0.1、1、5 mg·L-1的QC樣品各5份。HPLC進樣分析，每一濃度平行5樣本分析，連續測定3天，根據每批隨行標準曲線，計算QC樣品中CPT的濃度，以測得值與加入值之比計算方法回收率，并計算日內和日間精密度。

1.8.4萃取回收率 取空白血漿(空白組織)，制成含CPT 1 mg·L-1(0.1 mg·L-1)的QC樣品5份；不加空白血漿(空白組織)，同法制備制成含CPT 1 mg·L-1(0.1 mg·L-1)的甲醇溶液5份，分別取20 μL注入色譜儀，記錄色譜峰，得到萃取的CPT與內標峰面積和未經萃取的CPT與內標峰面積；以峰面積比值計算CPT與內標的萃取回收率。

1.8.5穩定性 取適量大鼠空白血漿樣品，配制成含CPT 0.1、1、5 mg·L-1的血漿樣品；取適量小鼠勻漿組織或血漿樣品，配制成含CPT 0.01、0.1、1 mg·L-1的勻漿組織或血漿樣品。將樣品放置冰箱中，經3次冷凍-融化循環、室溫下放置4 h以及樣品處理后上清液經室溫放置8 h后，HPLC進樣分析，考察樣品的穩定性。

2 結果

2.1 方法學評價

2.1.1大鼠體內分析方法學評價 專屬性 如Fig 1所示，大鼠血漿中內酯型CPT及其內標鹽酸伊立替康的出峰時間為8 min和5 min左右；內源性物質不干擾內酯型CPT及其內標的測定，方法專屬性良好。

Fig 1 HPLC chromatogram of rat plasma sample

A: Blank plasma; B: Blank plasma+CPT+internal standard; C: Plasma samples after administration; 1: Lactone CPT;2: Internal standard

標準曲線與定量下限 內酯型CPT線性回歸方程為：Y=0.39X+1.8×10-3，R2=0.9997；在(0.05～10)mg·L-1濃度范圍內，線性關系良好，定量下限為0.05 mg·L-1。

精密度與方法回收率 如Tab 1所示，定量下限、低、中、高4個濃度QC樣品的日內和日間精密度(RSD%)均小于15%，方法回收率大于98%。

萃取回收率 CPT與內標的萃取回收率分別為(57.08±1.96)%和(62.89±2.93)%，RSD小于5%，說明該提取方法穩定可靠。

穩定性 0.1、1、5 mg·L-1的大鼠血漿樣品經3次冷凍-融化循環、室溫下放置4 h以及樣品處理后上清液經室溫放置8 h后，穩定性結果RSD均小于8.04%，表明在上述條件下CPT穩定性良好。

2.1.2小鼠生物樣品測定方法學評價 專屬性 結果顯示，各生物樣品中的內源性物質不會干擾CPT及內標的測定。小鼠血漿與各組織色譜圖如Fig 2所示，內酯型CPT及其內標鹽酸伊立替康的出峰時間為8 min和5 min左右，以肝組織色譜圖為代表，其他組織與之類似。

標準曲線與定量下限 CPT在血漿與各組織的標準曲線見Tab 2。在線性范圍(0.01～5)mg·L-1內，線性關系良好，經實驗測得CPT的定量限為10 μg·L-1。

精密度與方法回收率 測得CPT在小鼠血漿和各組織中定量下限、低、中、高4個濃度QC樣品的日內精密度為3.54%～9.04%，日間精密度為 2.67%～8.56%，方法回收率在98.4%～104.0%內波動。

萃取回收率 各生物樣品中CPT和內標的萃取回收率穩定，RSD均小于10%，說明該提取方法穩定可靠。

穩定性 0.01、0.1、1mg·L-1的小鼠生物樣品經3次冷凍-融化循環、室溫下放置4 h以及樣品處理后上清液經室溫放置8 h后，穩定性結果RSD均小于9.18%，表明在上述條件下CPT穩定性良好。

2.2 血藥濃度——時間曲線大鼠尾靜脈注射CPT-Free和CPT-NC的平均血藥濃度—時間曲線見Fig 3。由Fig 3可見，高、中、低3個劑量下，CPT-NC組隨著給藥劑量的增大，各時間點血藥濃度變化趨勢一致，AUC(0-t)相應增大。而在相同給藥劑量下，CPT-NC組的AUC(0-t)明顯大于CPT-Free組，且CPT-Free組的血藥濃度下降較CPT-NC組快。

2.3 藥動學參數大鼠體內藥代動力學參數結果見Tab 3。如Tab 3所示，低、中、高劑量下，載CPT納米膠束的Cmax分別為(3.07±0.89、4.04±0.50和6.30±0.53)mg·L-1，AUC(0-t)分別為(30.13±3.18、43.49±4.56和56.58±6.18)mg·L-1·h，兩者隨著給藥劑量的增加而增加，在(0.25～1) mg·kg-1給藥劑量下呈線性關系。在相同給藥劑量下，結果載藥膠束的AUC(0-t)為(43.49±4.56)mg·L-1·h，CPT的AUC(0-t)為(33.01±2.95)mg·L-1·h，載藥膠束AUC為CPT的1.32倍，差異具有統計學意義(P<0.01)。載藥膠束的t1/2為(9.73±0.19)h，CPT的t1/2為(8.31±1.93)h，前者是后者的1.17倍，差異具有統計學意義(P<0.05)。

Fig 2 HPLC chromatogram of biological samples (A1. Blank plasma; A2. Blank plasma + CPT + internal standard; A3. Plasma samples after administration; B1. Blank liver; B2. Blank liver+ CPT + internal standard;B3. Liver samples after administration;1. Lactone CPT;2. Internal standard)

Fig 3 Average plasma concentration-time curve of CPT-free and CPT-NC after intravenous administration (n=5)

C/mg·L-1Intra-day x±s (mg·L-1)RSD/%Inter-dayx±s (mg·L-1)RSD/%Methodrecovery/%0.050.05±0.008.740.05±0.007.0899.30±7.790.10.10±0.015.530.11±0.018.17101.04±4.0911.01±0.065.921.04±0.054.61100.33±2.7055.25±0.346.135.14±0.386.93100.31±3.04

Tab 2 Standard curves of CPT in plasma and tissues(n=6)

2.4 組織分布結果小鼠尾靜脈注射CPT-Free和CPT-NC后不同時間內酯型CPT含量變化見Tab 4。

從表中可見，給藥0.5 h后，CPT-NC組在血漿中的濃度最大，CPT-Free組在肝組織的濃度最大，兩給藥組在心、肝、脾、肺、腎等多組織中均能檢測到一定濃度的內酯型CPT，表明注射給藥后內酯型CPT能較快分布到多種組織器官中。給藥1 h后，兩給藥組的脾、肺和腎中內酯型CPT濃度均有提升，特別是載藥膠束組在肺組織中達到峰值。給藥4 h后，各組織中CPT濃度均有一定程度的降低，至12 h各組織中仍能檢測到內酯型CPT。CPT-Free組的內酯型CPT在組織中暴露量的大小順序為肝>肺>心>脾>腎；CPT-NC組的內酯型CPT在組織中暴露量的大小順序為肺>心>肝>脾>腎。

Tab 3 Pharmacokinetic parameters of CPT-free and CPT-NC in

*P<0.05,**P<0.01vsCPT-free

Tab 4 CPT concentration at different time points in plasma and tissue of mice after CPT-free and CPT-CN injection(n=3,

*P<0.05,**P<0.01vsCPT-free

3 討論

CPT自然狀態下存在兩種形式：閉合內酯型和開環羧酸鹽型。在緩沖體系中，內酯型與羧酸鹽型的CPT之間存在著動態平衡[9]，但只有閉合內酯型的CPT能夠抑制Topo Ⅰ，因此本研究選擇測定內酯型CPT含量更能反映CPT在體內的真實情況。大鼠藥動學研究結果顯示，CPT-NC組的Cmax和AUC(0-t)隨著給藥劑量的增加而增加，在(0.25～1)mg·kg-1給藥劑量下呈線性關系。在相同給藥劑量下，CPT-NC組的AUC(0-t)為CPT-Free組的AUC(0-t)的1.32倍，表明膠束載藥系統對內酯型CPT具有保護作用，可以抑制內酯環CPT的開環。CPT-NC組的t1/2為CPT-Free組的t1/2的1.17倍。以上結果反映載藥膠束能有效保護內酯型CPT，提高其生物利用度，增強治療效果。該納米載藥膠束提高 CPT生物利用度的原因可能是： 其核-殼結構上的聚乙二醇可以減少載體與血液成分的相互作用，減少RES 系統的攝取和腎臟的清除，從而延長載藥膠束在體內的半衰期；加上空間立構復合物穩定性更好，可以有效保護CPT的內酯環；另外，CPT屬于難溶性藥物，通過膠束疏水端的包裹可以增加其溶解度，改善其在體內的吸收和分布；綜上所述，該新型納米載藥膠束可以有效提高CPT的生物利用度，并增強其治療效果。

小鼠體內組織分布的結果顯示：小鼠尾靜脈注射給藥后內酯型CPT在各組織中分布廣泛，各組織中均檢出內酯型CPT，且分布迅速，特別是肝和肺組織中。該載藥膠束可以通過其天然被動靶向發揮作用，如其對心臟和肝臟的靶向性；但一般被肺組織截留的粒子粒徑需大于7 μm，這遠遠大于納米膠束200 nm的粒徑，因此，其對肺的高親和性可能是因為聚乳酸空間立構復合膠束表面帶正電荷，而表面帶正電荷的粒子由于靜電作用更易被肺組織攝取。在整個體內過程中，CPT-NC組進入肺中的內酯型CPT含量都比CPT-Free組高很多，說明載藥膠束在肺中的靶向作用更強，提示我們載藥膠束對肺癌可能有較好的治療作用。而且，CPT-NC組在脾和腎臟中的分布較低，可以減輕對脾腎患者的毒副作用，在臨床治療上有重要意義。