芍藥苷-6′-O-苯磺酸酯通過調(diào)節(jié)JAK/STAT3/RORγ-t/IL-17A信號(hào)通路抑制人外周血Th17細(xì)胞的分化

朱 悅，湯小雨，蔡小雨，王 琛，張賢政，韓 樂，張玲玲，魏 偉

(安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所、抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、安徽省高校抗炎免疫藥物協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230032)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)以慢性滑膜炎及關(guān)節(jié)、軟骨和骨組織的破壞為特征，可導(dǎo)致全身性炎癥和自身抗體的產(chǎn)生，它是一種全身性自身免疫性疾病。T細(xì)胞亞群的失衡與T細(xì)胞的異常活化是RA發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素之一，其中Th17細(xì)胞作為輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th)的新亞型之一，在自身免疫病中占據(jù)重要地位。JAK是一種新型RA藥物作用靶點(diǎn)，JAK/STAT信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)過程，具有強(qiáng)效抗炎作用[1]。JAK/STAT信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子維A酸相關(guān)孤獨(dú)受體γ-t(retinoic acid-related orphan nuclear hormone receptor γ-t，RORγ-t)的表達(dá)。RORγ-t是Th17細(xì)胞的特異轉(zhuǎn)錄因子，它的激活可以促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化及細(xì)胞因子IL-17A的分泌，參與炎癥進(jìn)程[2,3]。白芍總苷于1998年在中國被批準(zhǔn)用于治療RA，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。芍藥苷-6′-O-苯磺酸酯(CP-25)是對白芍總苷的主要有效成分芍藥苷進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾得到的活性單體。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，CP-25可能通過調(diào)控T細(xì)胞亞群分化和活化對膠原性關(guān)節(jié)炎[4]、佐劑性關(guān)節(jié)炎[5]和干燥綜合征[6]動(dòng)物模型發(fā)揮治療作用，但是否通過JAK/STAT3/RORγ-t/IL-17A信號(hào)通路調(diào)控T細(xì)胞分化，目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)以JAK/STAT3及下游信號(hào)通路的活化為切入點(diǎn)，研究CP-25對人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中JAK/STAT3/RORγ-t/IL-17A信號(hào)通路的調(diào)節(jié)及Th17細(xì)胞分化的影響。

1 材料

1.1 樣本從健康人外周血(取自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)中分離的PBMCs。

1.2 藥物與試劑CP-25由安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所制藥部門提供，白色粉末，純度大于 98%；Recombinant Human TNF-α 購自novoprotein公司(批號(hào)：C008)；細(xì)胞刺激混合物(包含佛波酯、離子霉素、布雷菲爾德菌素A)購于美國eBioscience公司(批號(hào)：00-4975-03)；艾拉莫德購于江蘇先聲藥業(yè)有限公司國家藥品標(biāo)準(zhǔn)H20110084(25 mg·14粒/盒)；托法替布購于美國MCE公司(批號(hào)：HY-40354A)；人淋巴細(xì)胞分離液購于深圳達(dá)科為公司(批號(hào)：7111011)；RPMI 1640培養(yǎng)液購于美國Gibco公司(批號(hào)：11875093)；四季青特級(jí)胎牛血清購于浙江天杭公司(批號(hào)：13011-8611)；細(xì)胞增殖試劑盒購于天津百螢生物(批號(hào)：35001)；PE通道小鼠抗人IL-17A(批號(hào)：560438)、 FITC通道小鼠抗人CD4抗體(批號(hào)：555346)購自Becton Dickinson公司；STAT3(批號(hào)：12640)、p-STAT3(批號(hào)：9145)、JAK1(批號(hào)：3344)、JAK2(批號(hào)：3230)、JAK3(批號(hào)：8863)抗體購自Cell Signaling Technology公司；p-JAK1(批號(hào)：YP0154)、p-JAK3(批號(hào)：YP0756)抗體購自Immunoway公司；p-JAK2(批號(hào)：ARG57812)、IL-17A(批號(hào)：ARG55256)抗體購自Arigobio公司；RORγ-t抗體購自Novus Biologicals公司(批號(hào)：NBP2-24449)；Alexa Fluor 647標(biāo)記山羊抗兔熒光二抗(批號(hào)：FMS-RBaf64701)、Alexa Fluor 647 標(biāo)記山羊抗小鼠熒光二抗(批號(hào)：FMS-Msaf64701)購自南京福麥斯生物技術(shù)有限公司；ECL 發(fā)光顯色試劑盒購于美國Thermo Pierce試劑公司(批號(hào)：NCI4106)。

1.3 儀器Bio Tek Elx×808酶標(biāo)儀(美國Bio Tek公司)；FC500流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司)；KDC-40超速離心機(jī)(科大創(chuàng)新中佳公司)；ImageQuant LAS 4000熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國GE公司)；BX-50型正置顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 密度梯度離心法分離人PBMCs在無菌離心管中加入一定體積的人淋巴細(xì)胞分離液，用無菌PBS按照1 ∶ 1稀釋新鮮人抗凝全血。將稀釋后的血樣小心加到分離液上方后3 000 r·min-1離心30 min。用無菌巴氏吸管將血漿層與分離液層間單個(gè)核細(xì)胞層吸出，加入無菌PBS洗滌兩遍，離心棄上清，用含有10% FBS的RPMI 1640將底部離心下來的細(xì)胞重懸備用，得到的細(xì)胞懸液即為人PBMCs。

2.2 CCK-8法檢測CP-25對人PBMCs增殖功能的影響將2.1分離出的人PBMCs懸液計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109·L-1。在96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，加入TNF-α(10 μg·L-1)與細(xì)胞刺激混合物(2 mL·L-1)聯(lián)合刺激。按照空白對照組、刺激組、CP-25組(10 μmol·L-1)、艾拉莫德組(80 μmol·L-1)、托法替布組(10 μmol·L-1)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入10 μL CCK-8試劑，用錫箔紙包好培養(yǎng)板避光，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)30 min、1 h、2 h和3 h后，用酶標(biāo)儀檢測A450 nm值，選取合適時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測STAT3、p-STAT3、RORγ-t和IL-17A在人PBMCs中Th細(xì)胞的表達(dá)將人PBMCs細(xì)胞懸液鋪于24孔板中，每組4個(gè)孔，每孔5×106個(gè)細(xì)胞，按照空白對照組、細(xì)胞刺激劑刺激組、CP-25組、艾拉莫德組、托法替布組進(jìn)行刺激加藥處理，培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)板中的每孔細(xì)胞吸取轉(zhuǎn)移至ep管中，用PBS清洗2次，離心棄上清。加入150 μL PBS和5 μL表面抗體CD4(FITC通道)重懸細(xì)胞，避光室溫孵育20 min。PBS洗滌離心后進(jìn)行固定、破膜、封閉等操作，加入150 μL PBS重懸細(xì)胞，標(biāo)記每組的4管細(xì)胞分別為a、b、c、d。a管加入10 μL IL-17A(PE通道)進(jìn)行直接熒光標(biāo)記；b、c、d管分別加入10 μL STAT3、10 μL p-STAT3、10 μL RORγ-t一抗，避光室溫孵育1 h。加入PBS清洗兩次離心棄上清，a管直接加入250 μL PBS重懸細(xì)胞。b、c、d管分別加入10 μL相對應(yīng)的熒光二抗(Alexa Fluor 647)進(jìn)行間接熒光標(biāo)記避光室溫孵育2 h，PBS清洗離心棄上清，加入250 μL PBS重懸細(xì)胞。a、b、c、d管經(jīng)紗網(wǎng)過濾轉(zhuǎn)移至流式管，上機(jī)分別檢測人PBMCs中Th細(xì)胞中p-STAT3、STAT3、RORγ-t和IL-17A指標(biāo)的變化。

2.4 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)取人PBMCs細(xì)胞懸液接種于6孔板中，按照空白對照組、細(xì)胞刺激劑刺激組、CP-25組、艾拉莫德組、托法替布組進(jìn)行刺激加藥處理，培養(yǎng)24 h后用移液槍轉(zhuǎn)移至ep管中，離心棄上清。加入預(yù)冷PBS緩沖液洗滌兩次，離心棄上清。按照RIPA ∶ PMSF ∶ 磷酸酶抑制劑=98 ∶ 1 ∶ 1的比例配制110 μL的細(xì)胞裂解液，加入配制好的細(xì)胞裂解液充分混勻，冰上裂解30 min后，冰上超聲1 min，4 ℃，12 000 r·min-1，15 min離心留上清，即為總蛋白。取10 μL樣品進(jìn)行蛋白定量，剩余100 μL上清液加入蛋白上樣緩沖液混勻，沸水中煮10 min。配10%濃度的分離膠，經(jīng)過上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉等操作后，4 ℃孵育過夜一抗(1 ∶ 500)：p-JAK1、JAK1、p-JAK2、JAK2、p-JAK3、JAK3、p-STAT3、STAT3、RORγ-t、IL-17A，次日孵育二抗，顯影。

3 結(jié)果

3.1 CP-25對人PBMCs增殖功能的影響采用CCK-8法分析CP-25對人PBMCs增殖功能的影響。Fig 1結(jié)果顯示，與空白對照組相比，用細(xì)胞刺激劑刺激人PBMCs 24 h后，PBMCs的增殖反應(yīng)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與刺激組相比，CP-25、艾拉莫德和托法替布能明顯抑制細(xì)胞刺激劑誘導(dǎo)的人PBMCs的增殖反應(yīng)(P<0.01)。提示CP-25能夠抑制體外誘導(dǎo)的人PBMCs異常增殖反應(yīng)。

Fig 1 Effect of CP-25 on proliferation rate

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsstimulated

3.2 CP-25對人PBMCs中CD4+Th細(xì)胞的p-STAT3和STAT3表達(dá)的影響采用流式細(xì)胞術(shù)分析CP-25對人PBMCs中CD4+Th細(xì)胞的p-STAT3和STAT3表達(dá)的影響。與空白對照組相比，細(xì)胞刺激劑作用于人PBMCs 24 h后，可以明顯升高人PBMCs中Th細(xì)胞的p-STAT3和STAT3的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與刺激組相比，CP-25、艾拉莫德和托法替布能明顯降低人PBMCs中Th細(xì)胞的p-STAT3和STAT3的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(Fig 2A和2B)。提示CP-25可能通過調(diào)節(jié)JAK/STAT3信號(hào)通路下調(diào)人PBMCs中Th細(xì)胞的中p-STAT3和STAT3指標(biāo)。

3.3 CP-25對人PBMCs中CD4+Th細(xì)胞的RORγ-t表達(dá)和Th17細(xì)胞百分比的影響流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與空白對照組相比，細(xì)胞刺激劑作用于人PBMCs 24 h后，可以明顯升高人PBMCs中CD4+Th細(xì)胞的RORγ-t的表達(dá)和CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞的百分比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與刺激組相比，CP-25、艾拉莫德和托法替布能明顯降低人PBMCs中Th細(xì)胞的RORγ-t表達(dá)和CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞的百分比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(Fig 3A和3B)。提示CP-25可能通過調(diào)控JAK/STAT3/RORγ-t/IL-17A信號(hào)通路抑制Th17細(xì)胞的分化。

3.4 CP-25對人PBMCs中JAK/STAT3信號(hào)通路的影響采用Western blot分析CP-25對人PBMCs中JAK/STAT3信號(hào)通路的影響。Fig 4 結(jié)果顯示，與空白對照組相比，細(xì)胞刺激劑作用于人PBMCs 24 h后，可以明顯升高人PBMCs中p-JAK1、p-JAK2、p-JAK3、p-STAT3和STAT3蛋白表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而對JAK1、JAK2、JAK3蛋白表達(dá)無明顯作用。與刺激組相比，CP-25和托法替布能明顯降低人PBMCs中p-JAK1、p-JAK2、p-JAK3、p-STAT3和STAT3蛋白表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。艾拉莫德能明顯降低人PBMCs中p-JAK1、p-JAK2、p-JAK3、p-STAT3蛋白表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 4A和4B)。進(jìn)一步驗(yàn)證了CP-25對JAK/STAT3信號(hào)通路的調(diào)控作用。

3.5 CP-25對人PBMCs中RORγ-t、IL-17A蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組相比，細(xì)胞刺激劑作用于人PBMCs 24 h后，可以明顯升高人PBMCs中RORγ-t、IL-17A蛋白表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與刺激組相比，CP-25、艾拉莫德和托法替布能明顯降低人PBMCs中RORγ-t和IL-17A蛋白表達(dá)(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 5A和5B)。進(jìn)一步驗(yàn)證CP-25可能通過調(diào)控JAK/STAT3/RORγ-t/IL-17A信號(hào)通路抑制Th17細(xì)胞的分化。

4 討論

4.1 CP-25是一個(gè)潛在炎癥免疫反應(yīng)軟調(diào)節(jié)藥物已經(jīng)上市的治療RA的藥物主要包括非甾體抗炎藥、甾體抗炎藥、傳統(tǒng)改善病情抗風(fēng)濕藥等藥物，雖然治療作用明確但也存在不良反應(yīng)。炎癥免疫反應(yīng)軟調(diào)節(jié)(soft regulation of inflammatory immune responses, SRIIR)藥物能夠選擇性調(diào)控機(jī)體組織細(xì)胞功能、基因和蛋白異常變化所致的病理狀態(tài)并使其恢復(fù)至生理水平，該類藥物控制炎癥免疫應(yīng)答相關(guān)細(xì)胞過度活化且不損害其生理功能，因此，研發(fā)SRIIR藥物是未來抗炎免疫藥物的一個(gè)趨勢[7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CP-25能夠恢復(fù)干燥綜合征、佐劑性關(guān)節(jié)炎和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的炎癥指標(biāo)，緩解關(guān)節(jié)腫脹、降低脾臟組織病理學(xué)評(píng)分。CP-25主要通過調(diào)節(jié)T、B細(xì)胞亞群的增殖、活化和分化[8]，抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞[9]、內(nèi)皮細(xì)胞的異?；罨种芃1巨噬細(xì)胞活化，增強(qiáng)M2巨噬細(xì)胞極化，對免疫功能異常發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[11]。CP-25還可以通過調(diào)節(jié)GRK2的685位絲氨酸的磷酸化,從而影響GRK2與EP4的結(jié)合,使EP4受體復(fù)敏，改善RA患者滑膜細(xì)胞株功能從而發(fā)揮治療RA的作用[12]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α與細(xì)胞刺激混合物聯(lián)合刺激能誘發(fā)人PBMCs的異常增殖，CP-25能明顯抑制細(xì)胞刺激劑誘導(dǎo)人PBMCs的異常增殖，提示CP-25是一個(gè)潛在炎癥免疫反應(yīng)軟調(diào)節(jié)藥物。

Fig 2 Effect of CP-25 on p-STAT3 and STAT3 expression of Th cells in human

A：Effect of CP-25 on p-STAT3 expression of Th cells in human PBMCs; B：Effect of CP-25 on STAT3 expression of CD4+Th cells in human PBMCs.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsstimulated

Fig 3 Effect of CP-25 on RORγ-t expression of Th cells and Th17 percentage in human

A：Effect of CP-25 on RORγ-t expression of CD4+Th cells in human PBMCs; B：Effect of CP-25 on CD4+IL-17A+Th17 percentage in human PBMCs.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsstimulated

4.2 CP-25可能通過調(diào)節(jié)JAK/STAT3/RORγ-t/IL-17A信號(hào)通路抑制Th17細(xì)胞的分化RA炎癥條件下，JAK/STAT3通路的激活使RORγ-t表達(dá)增加，RORγ-t 作為控制Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它的激活可以啟動(dòng)Th17細(xì)胞的分化，并刺激Th17細(xì)胞分泌IL-17A[2]。除此之外，IL-6和TNF-α也可激活Th17細(xì)胞的分化以及IL-17A、IL-22等促炎癥因子的分泌。IL-17A具有強(qiáng)致炎作用，可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和招募白細(xì)胞，在促炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用[13]。細(xì)胞刺激混合物主要成分包括佛波酯、離子霉素、布雷菲爾德菌素A，前兩者可以刺激細(xì)胞分泌IL-17A，第3個(gè)成分能夠抑制IL-17A穿過細(xì)胞膜分泌到細(xì)胞外。艾拉莫德是國家食品藥品監(jiān)督管理局2011年8月臨床批準(zhǔn)的Ⅰ類新藥，用于治療成人活動(dòng)性RA。文獻(xiàn)報(bào)道艾拉莫德可以通過下調(diào)Th17細(xì)胞百分比，同時(shí)上調(diào)Treg細(xì)胞百分比來恢復(fù)RA患者內(nèi)環(huán)境的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，從而緩解疾病發(fā)展[14]。托法替布是一種與 ATP 高度相似、但無磷酸基團(tuán)的小分子化合物，這種結(jié)構(gòu)相似性使其能與 ATP 競爭性結(jié)合并抑制 JAK 激酶活性[15]。托法替布作為最早被批準(zhǔn)用于治療RA的JAK抑制劑，能明顯抑制JAK3、JAK1活性，較小程度抑制JAK2活性，對RA等炎癥免疫疾病發(fā)揮治療作用，本實(shí)驗(yàn)選用艾拉莫德和托法替布作為陽性對照藥。

Fig 4 Effect of CP-25 on JAK/STAT3 signaling

A:Expression of p-JAK1, JAK1, p-JAK2, JAK2, p-JAK3, JAK3, p-STAT3 and STAT3 protein was detected by Western blot; B: The difference of p-JAK1, p-JAK2, p-JAK3, p-STAT3 and STAT3 protein expression in human PBMCs between different groups was compared.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsstimulated

Fig 5 Effect of CP-25 on expression of RORγ-t and IL-17A protein in human

A:Expression of RORγ-t and IL-17A protein was detected by Western blot; B: The difference of RORγ-t and IL-17A protein expression in human PBMCs between different groups was compared.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsstimulated.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNF-α與細(xì)胞刺激混合物聯(lián)合刺激的人PBMCs中CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞的百分比顯著升高，CP-25能明顯降低人PBMCs中CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞的百分比，抑制人PBMCs的異常增殖，這些結(jié)果表明CP-25可能通過抑制Th17細(xì)胞的分化抑制人PBMCs的異常增殖，緩解炎癥反應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞刺激劑誘導(dǎo)人PBMCs中CD4+Th細(xì)胞的p-STAT3、STAT3、RORγ-t、IL-17A表達(dá)明顯升高，CP-25能明顯降低p-STAT3、STAT3、RORγ-t、IL-17A表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CP-25是否通過調(diào)節(jié)JAK/STAT3/RORγ-t/IL-17A信號(hào)通路抑制Th17細(xì)胞的分化，我們采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測通路相關(guān)蛋白。結(jié)果表明細(xì)胞刺激劑誘導(dǎo)人PBMCs中p-JAK1、p-JAK2、p-JAK3、p-STAT3、STAT3、RORγ-t和IL-17A蛋白表達(dá)明顯升高，CP-25能明顯降低人PBMCs中p-JAK1、p-JAK2、p-JAK3、p-STAT3、STAT3、RORγ-t和IL-17A蛋白表達(dá)。上述結(jié)果提示CP-25可能通過調(diào)節(jié)JAK/STAT3/RORγ-t/IL-17A信號(hào)通路抑制Th17細(xì)胞的分化，從而調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能。

綜上所述，JAK/STAT3信號(hào)通路的激活促進(jìn)了Th17細(xì)胞的分化，導(dǎo)致T細(xì)胞亞群失衡。CP-25可能通過調(diào)節(jié)JAK/STAT3/RORγ-t/IL-17A信號(hào)通路抑制Th17細(xì)胞的分化，參與T細(xì)胞亞群平衡的調(diào)節(jié)，提示CP-25具有良好的抗炎免疫軟調(diào)節(jié)活性。本研究為進(jìn)一步闡明CP-25藥理作用機(jī)制以及將CP-25開發(fā)為治療RA的抗炎免疫軟調(diào)節(jié)藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。