李越，吳中寶，楊艷玲，胡等慧，王秀麗*

1.北京中醫藥大學，北京 102488；2.重慶市藥物種植研究所，重慶 408435

創面是正常皮膚組織在某些外界因素的作用下所導致的損害，如高溫導致的燒燙傷、機械性損害導致的皮膚創傷、低溫導致的凍傷等[1]。其中燙傷發生頻率不僅高，而且較機械創傷更為復雜，治療難度大。

紅景天苷(salidroside)來源于景天科植物紅景天，具有抗衰老、免疫調節、清除自由基等作用，目前國內外對紅景天的藥理作用研究主要集中在心血管疾病、預防衰老、抗腫瘤、改善糖尿病癥狀、保護肺纖維化等疾病的治療上[2-3]，暫未檢索到對燙傷的治療，但有研究表明，紅景天苷可通過多種途徑發揮抗炎作用[4]。目前紅景天主要成分紅景天苷制劑暫無外用制劑，而紅景天作為傳統中藥，在許多典籍中均有活血通瘀、強健機體的記載。因此本研究試圖開拓紅景天苷的治療領域及給藥形式，將紅景天苷承載于便于創面涂抹、透氣、溫和不刺激的乳劑凝膠，建立大鼠Ⅱ度燙傷的創傷模型，以紅景天苷乳劑凝膠外敷，通過檢測治療效果，考察紅景天苷對Ⅱ度燙傷的愈合作用，并探究其作用機制，為擴展紅景天苷的應用范圍提供參考。

1 材料

1.1 儀器

OLYMPUS BX51型顯微鏡(北京銳馳恒業儀器科技有限公司)；FA1204B型分析天平(上海精密儀器儀表有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；3-18N臺式高速離心機(湖南恒諾儀器設備有限公司)；超聲波細胞粉碎機(寧波新芝科技股份有限公司)。

1.2 動物

SD大鼠，雌雄各半，體質量為200～220 g。合格證號 SCXK(京)2016-0002，購于北京斯貝福實驗動物科技有限公司，飼養于北京中醫藥大學動物房。

1.3 試藥

紅景天苷乳劑、復合乳化劑(實驗室自制)；京萬紅軟膏(天津達仁堂京萬紅藥業有限公司)；10%中性福爾馬林固定液(北京益利精細化學品有限公司)；卡波姆、甘油、EGF抗體、bFGF抗體(上海源葉生物有限公司)；水合氯醛(天津市福晨化學試劑廠)；注射用青霉素鈉(江西省科達動物藥業有限公司)；絡合碘消毒液(湖南省廣盛源醫藥科技有限公司)；0.9%氯化鈉溶液(江西科達衛生用品有限公司)。

2 方法與結果

2.1 紅景天苷乳劑的制備

將處方量油相中加入復合乳化劑，超聲使其分散均勻，水浴60 ℃保溫，作為油相溶液；另取處方量紅景天苷溶于純水中，溶解后60 ℃保溫，作為水相溶液；兩相均保溫至60 ℃時，立即將水相加入至油相中，攪拌得初乳，置于高速均質分散機中，11 000 r·min-1均質5 min即得終乳。

2.2 紅景天苷乳劑凝膠的制備

稱取卡波姆與甘油適量，研勻后充分溶脹；取2.1方法下制成的紅景天苷乳劑10 mL，稀釋后滴加至溶脹的凝膠中；調整pH，并加溶脹液至100 g，攪勻，于4 ℃密閉貯存。

2.3 紅景天苷乳劑凝膠的處方工藝優化

2.3.1乳劑凝膠成形評分標準 以凝膠的外觀、延展性、均勻度、離心性的綜合評分為考察指標，篩選適宜的凝膠制備處方[5-6]。評分標準見公式(1)，具體評分標準見表1。

綜合評分(100分)=外觀評價(25分)+ 延展性(25分)+均勻度(25分)+離心性(25分) (1)

2.3.2Box-Behnken響應面法優化處方工藝 根據2.2的制備方法制備乳劑凝膠，對卡波姆的用量、乳劑用量、甘油用量及pH等因素進行考察。預實驗結果發現，對乳劑凝膠的理化性質影響較大的3個因素分別是卡波姆用量、甘油用量及pH。因此，本研究將卡波姆用量(A)、甘油用量(B)、pH(C)3個因素設為自變量，以乳劑凝膠成形綜合評分Y為評價指標，考察各因素對乳劑凝膠的影響，每個因素選取低、中、高3個水平，設計因素水平見表2，實驗安排及結果見表3。

表2 乳劑凝膠處方篩選設計試驗因素與水平

表3 Box-Behnken響應面法優選紅景天苷乳劑凝膠 處方工藝試驗設計及其結果

2.3.3模型擬合 采用Design-Expert 對上面數據進行分析，以Y對自變量進行模型擬合，并通過r等對擬合模型進行評價，通過比較各擬合方程的擬合度，得到二次多項式回歸方程Y=81.40-11.12A+9.13B+1.50C+2.00AB-2.75AC-1.25BC-1.95A2-0.45B2-18.20C2，r=0.991 3，P<0.001，F=88.15，表明模型差異有統計學意義；失擬項P=0.345 1>0.05，失擬項不顯著，說明該模型擬合度和可信度均有效，試驗誤差小，可以用此模型對紅景天苷乳劑凝膠的處方優化進行分析和預測。具體結果見表4。

表4 二次多項式方程模型方差分析

2.3.4響應面優化分析 根據擬合方程，通過Design-Expert 8.0.6軟件繪制評價指標綜合評分隨因素變化的等高線圖和響應面圖，具體結果見圖1～6。

圖2 卡波姆用量-甘油用量響應面圖

圖3 卡波姆用量-pH等高線圖

由圖1和2可以看出，卡波姆用量和綜合評分呈負相關，甘油用量和綜合評分呈正相關，即隨著卡波姆用量的減少和甘油用量的增加，綜合評分在一定范圍內增加；由圖3和4可以看出，pH對綜合評分的影響成拋物線形，即隨著pH的升高，綜合評分呈先增大后降低的趨勢，但pH對于綜合評分的影響差異無統計學意義；由圖5和6可以看出，在選定范圍內的pH對于綜合評分幾乎沒有影響，但隨著甘油用量的的提高，綜合評分達到最大值，當甘油用量繼續升高時，綜合評分緩慢降低。因此，在實際生產中應控制pH在最佳范圍。

圖4 卡波姆用量-pH響應面圖

圖5 甘油用量-pH等高線圖

圖6 甘油用量-pH響應面圖

2.3.5響應面預測和驗證 利用Design-Expert 8.0.6版軟件優化處方，得到紅景天苷乳劑凝膠的最優處方：卡波姆用量為0.5%，甘油用量為15 g，pH為6.5，此時綜合評分為97.37分。按照優化的處方劑量制備3批紅景天苷乳劑凝膠樣品進行綜合評分，與預測值的RSD<5%，說明所得實驗結果重現性好，制備工藝穩定。

2.4 大鼠Ⅱ度燙傷藥效實驗

2.4.1造模及給藥 將大鼠常規飼養3 d后，用剃毛刀剃去背部長毛，再涂上脫毛膏，3 min后脫去后背部區域的毛發，溫水清洗拭干，適應喂養24 h，避免大鼠背部皮膚對脫毛膏過敏。實驗組大鼠用10%水合氯醛麻醉[用量0.3 mL·(100 g)-1]，用乙醇消毒脫毛區域，然后在背部脊柱左右兩邊各1 cm處，以自制的直徑18 mm的離心管注入15 mL 100 ℃熱水，在大鼠背部持續燙8 s，制成對稱的2個圓形深Ⅱ度燙傷創面[7-8]，術中注意保暖，大鼠側身放置，避免大鼠窒息死亡。

造模成功后，將大鼠隨機分為3組，大鼠燙傷模型組(A組)：常規飼養，不給藥，涂碘伏消毒；乳劑凝膠組(B組)：給予紅景天苷乳劑凝膠外敷，每天1次；陽性藥組(C組)：常規飼養，給予京萬紅軟膏外敷，每天1次，每個燙傷創面用量約為0.05 g·min-1。每組大鼠在3、6、11、15、21 d觀察狀態并取材。

2.4.2大鼠形態觀察 于燙傷造模后大鼠復蘇時肉眼觀察，并于燙傷后1、3、6、9、11、15、21 d觀察創面狀態，記錄滲出物、感染、結痂紅腫等情況，并拍照。

實驗結果顯示，大鼠背部皮膚燙傷后，燙傷面為白色，小部分為紫紅色，有輕微水腫，燙傷面質地變硬，無感染現象。燙傷面肉眼觀察符合燙傷后深Ⅱ度燙傷的外觀表現。在后續觀察中，各組均有不同程度的愈合，其中模型組恢復最慢，直至給藥后第11 d才有較明顯愈合趨勢；給藥組恢復效果較好，給藥后第6天，給藥組燙傷面已經開始脫痂；給藥后第15天，給藥組燙傷面細皮較多，且未再次形成痂皮；給藥后第21天，乳劑凝膠組大鼠背部燙傷面己完全被上皮覆蓋，毛發生長較多，皮膚組織及功能均已恢復正常，陽性藥組大鼠背部燙傷面大部分已愈合，但仍有小部分燙傷面的痂皮未脫落，且皮膚有輕微癬痕，而模型組燙傷面仍有較為明顯的燙痕，且愈合率較低。

2.4.3燙傷創面愈合率 用透明硫酸紙描下燙傷輪廓，將所描的透明硫酸紙剪下，然后用萬分之一天平稱定其質量，以質量代替面積。將燙傷造模后1 d的面積作為原始面積，計算燙傷6、11、15、21 d的愈合率，具體結果見表5。與模型組相比，給藥3 d后，各組大鼠燙傷面面積無明顯變化；在第6、11、15、21天燙傷面愈合率明顯增加，且差異有統計學意義(P<0.05)。此結果表明，紅景天苷乳劑凝膠對大鼠深Ⅱ度燙傷創面具有修復作用。

燙傷創面愈合率=(原始燙傷面積- 各時間點未愈合面積)/原始燙傷面積×100%

(2)

2.4.4HE染色觀察 實驗結束后處死動物，取每組大鼠第3、6、11、15、21天時的局部燙傷皮膚HE染色(蘇木素染細胞核，伊紅染細胞質)，觀察不同時間點的表皮再生、真皮中炎癥細胞、成纖維細胞、膠原纖維的生長情況，具體結果見圖7。

表5 燙傷后不同時間各組燙傷面愈合率的比較 %

注：與模型組相比，☆P<0.05；與紅景天苷乳劑凝膠組相比，▽P<0.05，其余P>0.05。

由圖7可知，各組3 d時，可見表皮層及毛囊、皮脂腺被嚴重破壞，組織排列紊亂，有炎性細胞浸潤；6 d時，模型組表皮層結構壞死，無膠原細胞生成，真皮層有大量炎細胞浸潤；11 d時，與模型組相比，給藥組組織排列趨于均勻，炎性細胞浸潤減少，成纖維細胞數量增加，有少量毛囊及皮脂腺出現，其中紅景天苷乳劑凝膠組更明顯；15 d時，模型組表皮層結構形成，真皮層大量炎癥細胞浸潤，可見少量成纖維細胞；陽性對照組與乳劑凝膠組新生表皮層組織結構分明，膠原纖維密集，毛囊密集清晰可見，間質中有少量炎性細胞浸潤。21 d時，模型組可見表皮結構，僅有少量炎癥細胞；陽性對照組與乳劑凝膠組可見完整的表皮層，真皮層可見新鮮毛囊組織。

2.4.5表皮性長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)陽性細胞檢測 實驗結束后處死動物，取每組大鼠第3、6、11、15、21 d時的局部燙傷皮膚，免疫組化染色后，檢測燙傷肉芽組織中EGF、bFGF陽性細胞，利用image-pro plus 6.0圖像分析系統觀察分析結果，結果用平均光密度表示。由實驗結果可知，各組實驗大鼠在燙傷愈合的過程中，第6、11、15、21天紅景天苷乳劑凝膠組與陽性對照組肉芽組織中bFGF和EGF表達量都明顯高于模型組，且兩者與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)。具體結果見表6～7。

表6 不同時期肉芽組織中bFGF的表達

注：與模型組比較，*P<0.05；與紅景天苷乳劑凝膠組比較，△P<0.05。下同。

表7 各組大鼠燙傷面愈合過程中不同時期肉芽組織中 EGF的表達

3 討論

臨床上外用制劑常用的有膏劑、洗劑、搽劑等，但這些傳統劑型易造成涂布不均、污染衣物，有的還具有易揮發的缺點，因此臨床應用具有一定的局限性。而外用凝膠是藥物與輔料制成的均一、混懸的稠厚液體或半固體制劑。其局部給藥后，患處表面皮膚吸收良好，可以避免口服給藥存在的肝臟首過效應和胃腸道的破壞，降低藥物的不良反應，除此之外，凝膠劑還有使用舒適、生物利用度高、易清潔等優點。本研究選取的凝膠基質為卡波姆，其具有釋藥快、易涂展、對皮膚無刺激性和過敏性等優點，非常適合作為創傷的外用制劑。因此，本研究將乳劑和凝膠相結合，制備了乳劑型凝膠，結果顯示乳劑型凝膠適用于燙傷創面的治療。

本研究優化紅景天苷乳劑凝膠處方時采用的是Box-Behnken響應面法，目前國內篩選處方多采用單因素考察、正交設計或均勻設計法尋求最佳的因素水平組合，但不能在給出的整個區域上找到因素和響應值之間的一個明確的函數表達式，從而無法找到整個區域上因素間的最佳組合和響應最優值。而本研究采用的Box-Behnken響應面法是通過表2～3的設計得到一定的實驗數據，然后采用多元二次方程來擬合因素和效應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優工藝參數(見表4)，是解決多變量問題的一種高效的統計方法。驗證實驗結果也顯示，本研究理論優化結果與試驗值差異較小，采用的非線性擬合模型接近客觀事實，同時通過圖1～6的響應面三維圖也將各因素對指標的影響作用更為直觀、方便地表現出來。

關于治療效果，根據表5的實驗結果可以看出，給藥后21 d，給藥組創面均已基本愈合，傷口愈合率自給藥后均明顯高于模型組(P<0.05)，且在相同時段內，乳劑凝膠組較陽性對照組愈合率明顯更高(P<0.05)。說明紅景天苷乳劑凝膠可加快燙傷創面的愈合速度，減小創面面積，與陽性藥相比，肉眼觀察效果大致相當。從圖7 HE染色切片的結果中可以看出，前3 d各組組織結構不清晰，且炎性細胞浸潤明顯。自第6天起，給藥組鏡下可見新生表皮和新生纖維分化良好，排列整齊，愈合趨勢明顯。

燙傷有凝血期、炎癥期、組織生成期、組織塑形階段等過程，在這些過程中發揮作用的有中性粒細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、內皮細胞、角質細胞等[9]。凝血期最先發生，主要是止血的過程。炎癥期持續時間較長，一般為3～5 d，分為炎癥早期與炎癥后期，炎癥早期主要是清除微生物，后期主要是形成焦痂，清除炎癥細胞，同時在缺氧環境下產生大量生長因子，如血管內皮生長因子(VEGF)、EGF、bFGF、轉化生長因子(TGF)等[10-11]。表6～7的結果表明，紅景天苷乳劑凝膠組從第6天開始到第21天，EGF與bFGF的表達都顯著增加，說明了紅景天苷乳劑凝膠在一定程度上加快了發生創面的愈合速度，其原因可能是促進了EGF與bFGF的表達。

綜上所述，本研究采用Box-Behnken響應面法優選的紅景天苷乳劑凝膠的處方工藝，操作簡單、質量穩定、重現性好。且其對大鼠Ⅱ度燙傷模型有良好的治療作用，其作用機制可能是提高創面EGF和bFGF的表達而實現的。因此，本研究對擴展紅景天苷治療領域及新給藥形式的進一步開發與利用提供了新思路。