探討調控成年大鼠心肌細胞再生與調節性T細胞的關系

陸宏，陶杰，羅雪婷，黃宏波

昆明醫科大學第一附屬醫院心血管外科，云南昆明 650032

心力衰竭是常見的一種危害人類健康的病癥， 心肌細胞丟失是心力衰竭發生的根本原因， 這與人類的心肌細胞的實質有密切的關系[1]。 心肌細胞實質上是細胞的終末分化， 絕大部分人的心肌細胞在受到損傷后都不能通過迅速地增殖來得到恢復，因此，心力衰竭危害巨大。 目前治療心力衰竭的最有效辦法就是移植心臟， 但是有效的心源數量有限[2]。 而近年來，隨著生活方式、環境等的改變， 因為心肌細胞受損而產生心力衰竭的患者數量正在急劇上升，心臟短缺的問題成為臨床上的重要研究話題，研究能解決目前心力衰竭治療中存在的問題方法具有重要的意義[3]。 再生醫學是近年來新晉的一種醫學模式，為心力衰竭患者的治療提供了新的思路。 利用再生醫學方法再生受損位置的心肌細胞成為心力衰竭治療方法的主要研究方向， 是徹底解決心力衰竭患者困難的最有希望的方法[4-5]。 探討心肌細胞具體的再生機制，創造出有效的治療心力衰竭的治療方法具有重要的意義， 該文以調節性T 細胞與成年大鼠心肌細胞再生的關系為主題， 進行了相關的研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

該實驗所用的大鼠均為北京市維通利華實驗動物技術有限公司提供。 使用德國美天旎公司生產的大鼠心臟解離試劑盒，Abcam 生產的Western 印跡中Foxp3 抗體，Sigma 公司生產的Masson 染色試劑盒，R&D Systems 生產的免疫組化Foxp3 抗體， 北京中杉金橋生物技術有限公司生產的GAPDH 抗體， BD 生產的高速流式細胞分選系統FACSAria II ， Invitrogen 生產的Western 電泳儀，Zeiss生產的共聚焦顯微鏡、全自動掃片機。

1.2 方法

1.2.1 手術方法心尖切除手術： 研究組大鼠進行心尖切除術， 對照組大鼠進行假手術， 即手術操作均同研究組大鼠，只是不切除心尖。

1.2.2 測試法采用Western 印跡檢測Foxp3， 然后利用流式細胞儀檢測大鼠心臟的T reg 細胞數目， 主要檢測CD25+、CD4+的細胞數目。 再測試T reg 細胞心肌再生能力之間的影響，在研究組大鼠的頸背部注入白喉毒素，連續為大鼠注射7 d，用免疫熒光染色檢測法檢測兩組的抑炎因子（IL-10、IL-13、TGF-α）、轉化生長因子（TGF-α、IL -1β）、促炎因子（IL-1β、IL-6）數目。

1.3 觀察指標

觀察兩組術后14 dFoxp3、CD25+、CD4+數、 抑炎因子、轉化生長因子、促炎因子數量。

1.4 統計方法

使用SPSS 20.0 統計學軟件對數據進行分析，計量資料采用（±s）表示，進行t 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組術后14 d Foxp3、CD25+、CD4+數比較

比較兩組手術后14 d 的Foxp3 和CD25+、CD4+數，研究組的Foxp3 和CD25+、CD4+數明顯多于對照組， 差異統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組術后14 d Foxp3、CD25+、CD4+數比較[（±s），%]Table 1 Comparison of the numbers of Foxp3, CD25+, and CD4+at 14 days after operation between the two groups[(±s)，%]

表1 兩組術后14 d Foxp3、CD25+、CD4+數比較[（±s），%]Table 1 Comparison of the numbers of Foxp3, CD25+, and CD4+at 14 days after operation between the two groups[(±s)，%]

組別 Foxp3 CD25+ CD4+研究組（n=20）對照組（n=20）t 值P 值7.34±1.72 5.34±1.25 3.643 0.001 23.34±2.72 15.34±2.42 8.510 0.001 25.32±2.61 14.32±2.41 11.992 0.001

2.2 兩組抑炎因子、轉化生長因子、促炎因子比較

比較兩組的抑炎因子、轉化生長因子、促炎因子，研究組的抑炎因子和轉化生長因子明顯降低， 促炎因子明顯上升，治療后差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組抑炎因子、轉化生長因子、促炎因子比較[（±s），pg/mL]Table 2 Comparison of two groups of anti-inflammatory factors,transforming growth factors,and pro-inflammatory factors[（±s），pg/mL]

表2 兩組抑炎因子、轉化生長因子、促炎因子比較[（±s），pg/mL]Table 2 Comparison of two groups of anti-inflammatory factors,transforming growth factors,and pro-inflammatory factors[（±s），pg/mL]

組別IL-10 IL-13 TGF-α IL-1β IL-6研究組（n=20）對照組（n=20）t 值P 值114.83±35.49 186.12±31.60 5.810 0.001 132.83±26.34 174.83±35.32 3.692 0.001 6.35±1.12 19.12±2.35 18.999 0.001 23.14±4.12 10.43±1.63 11.110 0.001 135.83±12.32 72.83±15.35 12.397 0.001

3 討論

探討解決心力衰竭的方法一直是醫學界的重點話題，而再生醫學的出現與繼續研究為其提供了新的思路，該文立足這一點對這一問題進行了探討。 根據相關研究報道，低等級的脊椎動物具有強大的心肌再生功能，如斑馬魚在切除20%的心尖組織后， 經過2 個月的時間就可以保證心肌功能恢復到原來的正常水平， 此后有研究報道，老鼠具有更快的心肌恢復功能，成為開展心肌再生研究的理想模型[5-6]。 調節性T 細胞免疫抑制炎癥的功能在防治心血管方面疾病中有著重要的作用，有研究報道[7]，T細胞能增殖心肌細胞的再生功能， 能促進胚胎心肌細胞的增殖，在女性懷孕期間也能有同樣的作用。 但是目前對于T 細胞和心肌再生功能方面的研究報道較少。 該文以這一問題為切入點， 研究T 細胞在心肌再生功能方面的作用。 該文以成年大鼠構建成年大鼠心尖切除再生型，進行了心肌細胞的再生功能和調節T 細胞的關系研究。

該文首先對研究組和對照組患者的T 細胞含量進行了比較， 研究組患者的Foxp3、CD25+、CD4+含量分別為（7.34±1.72）、（23.34±2.72）、（25.32±2.61），而對照組相應指標含量分別為（5.34±1.25）、（15.34±2.42）、（14.32±2.41），這證明T 細胞和大鼠的心肌再生功能緊密相關，T 細胞能增殖心肌細胞的再生功能，能促進胚胎心肌細胞的增殖，在王睿琪等[8]研究者的研究中，敲除TLR4 后，WT-control 組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+等值依次為 （25.3±0.8）%、（17.8±0.8）%、（1.43±0.06）%，WT-ISO 組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+值依次為（29.1±1.0）%、（11.7 ±0.4%）、（2.49 ±0.11）%；WTISO-rHMGB1 組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+值依次為 （33.3±0.8）%、（10.3 ±0.4）%、（3.22 ±0.13）， 表明T 細胞和心肌再生功能存在緊密聯系，和該文研究結果相似。

研究者在調節性T 細胞對心肌再生功能的研究中的研究結果相似。 而后，為了進一步的明確T 細胞參與了心肌細胞的再生功能，該研究利用白喉毒素敲除了T 細胞，研 究 組IL-10、IL-13TGF-α、IL-1β、IL-6 含 量 分 別 為（114.83 ±35.49）pg/mL、 （132.83 ±26.34）pg/mL、 （6.35 ±1.12）pg/mL、（23.14±4.12）pg/mL、（135.83±12.32）pg/mL，對照 組 相 關 含 量 分 別 為 （186.12±31.60）pg/mL、（174.83±35.32）pg/mL、 （19.12 ±2.35）pg/mL、 （10.43 ±1.63）pg/mL、（72.83±15.35）pg/mL， 研究組的大鼠抑炎因子和轉化生長因子明顯降低，促炎因子明顯上升，證明T 細胞功能缺失后，成年大鼠的炎癥反應更為劇烈，心肌細胞的增殖功能受到明顯抑制， 最終結局將是導致成年大鼠丟失心肌再生功能， 由此證明，T 細胞和心肌再生功能存在密切聯系[9]。調節性T 細胞以Foxp3、CD25、CD4 為表型特征，是一組具有免疫抑制功能的T 細胞亞群，包括Treg 細胞、T 輔助細胞，與人體的免疫調節功能存在密切的關系。 可以通過IL -10、IL-35、TGF-β 等因子，抑制T 細胞活化[10-11]。此外，還能通過對IL-2 受體產生作用，增殖T 細胞的活化。 當敲除T 細胞后， 研究組的心肌增殖功能明顯受限則證明了這一點，這和王睿琪等[8]研究者認為的T 細胞可調節心肌功能結果一致。

綜上所述， 調節性T 細胞與成年大鼠的心肌細胞再生功能存在密切的聯系， 對成年大鼠的心肌細胞有調控作用，能促進心肌細胞快速增殖，促進心臟修復，其細胞的數量和功能的強弱與成年大鼠體內的炎癥反應呈反比，其調節功能減弱，大鼠體內的抑炎因子、轉化生長因子將明顯降低，促炎因子將明顯上升，炎癥反應加劇，最終導致大鼠的心肌細胞再生能力缺失。