HPLC-CAD法測定3種藥用石斛中3種糖類成分的含量

鄭曉倩 金傳山 張亞中 劉軍玲 俞年軍 歐金梅

中圖分類號 R282.71;R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）10-1185-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.10.06

摘 要 目的：建立測定3種藥用石斛中3種單/雙糖成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜-電噴霧式檢測器法。色譜柱為Shodex Asahipak NH2P-50 4E，流動相為乙腈-水（75 ∶ 25，V/V），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 ?L，數據采集頻率為5 Hz，過濾常數為5 s，霧化器溫度為35 ℃，氣源為氮氣，壓力為4.012×105 Pa。結果：果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖檢測質量濃度的線性范圍分別為0.156 2～1.873 8 mg/mL（r=0.999 5）、0.012 7～0.152 4 mg/mL（r=0.999 7）、0.277 6～3.331 2 mg/mL（r=0.999 8）;定量限分別為0.002 61、0.004 24、0.005 12 mg/mL，檢測限分別為0.000 78、0.001 27、0.001 54 mg/mL;精密度、穩定性、重復性、耐用性試驗的RSD均小于3%，加樣回收率分別95.98%～98.15%（RSD=0.83%，n=6）、95.64%～98.62%（RSD=1.10%，n=6）、97.53%～98.94%（RSD=0.53%，n=6）;含量分別為0.28%～1.12%、0.02%～0.13%、0.76%～2.67%;總含量為1.38%～3.10%。3種石斛中糖類成分含量高低依次為蔗糖>果糖>D-無水葡萄糖，其中蔗糖含量及總含量高低依次均為霍山石斛>銅皮石斛>鐵皮石斛，D-無水葡萄糖含量高低依次為霍山石斛>鐵皮石斛>銅皮石斛，果糖含量高低依次為銅皮石斛>鐵皮石斛>霍山石斛。結論：所建方法靈敏度高、重復性好、操作簡單，可用于測定3種藥用石斛中3種糖類成分的含量;3種藥用石斛中糖類成分的含量存在差異。

關鍵詞 高效液相色譜-電噴霧式檢測器法;霍山石斛;鐵皮石斛;銅皮石斛;單糖成分;雙糖成分;含量測定

Content Determination of 3 Saccharides in 3 Kinds of Medicinal Dendrobii Caulis by HPLC-CAD

ZHENG Xiaoqian1，JIN Chuanshan1，ZHANG Yazhong2，LIU Junling2，YU Nianjun1，OU Jinmei1（1. College of Pharmacy， Anhui University of TCM， Hefei 230012， China; 2. Anhui Institute for Food and Drug Control， Hefei 230051， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the content determination method of 3 mono/disaccharides in 3 kinds of medicinal Dendrobii Caulis. METHODS： HPLC-CAD method was established. The determination was performed on Shodex Asahipak NH2P-50 4E column with mobile phase consisted of acetonitrile-water （75 ∶ 25，V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃， and sample size was 10 ?L. CAD detection condition included that data acquisition frequency was 5 Hz， filter constant was 5 s， atomization temperature was 35 ℃， gas source was nitrogen with pressure of 4.012×105 Pa. RESULTS： The linear range of fructose， D-anhydrous glucose and sucrose were 0.156 2-1.873 8 mg/mL（r=0.999 5）， 0.012 7- 0.152 4 mg/mL（r=0.999 7）， 0.277 6-3.331 2 mg/mL（r=0.999 8）， respectively. The limits of quantification were 0.002 61， 0.004 24 and 0.005 12 mg/mL， and the limits of detection were 0.000 78， 0.001 27 and 0.001 54 mg/mL， respectively. RSDs of precision， stability， reproducibility and durability tests were all lower than 3%. The recoveries were 95.98%-98.15%（RSD=0.83%， n=6）， 95.64%-98.62%（RSD=1.10%， n=6） and 97.53%-98.94%（RSD=0.53%， n=6）. The contents of them were 0.28%-1.12%， 0.02%-0.13%， 0.76%-2.67%， respectively. The total content was 1.38%～3.10%. The order of saccharide content in 3 kinds of Dendrobii Caulis was sucrose>fructose>D-anhydrous glucose; the order of sucrose content and total content were Dendrobium huoshanense>D. moniliforme>D. officinale; the order of D-anhydrous glucose content was D. huoshanense>D. officinale>D. moniliforme;? the order of fructose content was D. moniliforme >D. officinale >D. huoshanense. CONCLUSIONS： Established method is sensitive， reproducible and simple in operation， and can be used for content determination of 3 saccharides in 3 kinds of medicinal Dendrobii Caulis. There are differences in the contents of saccharides among 3 kinds of Dendrobii Caulis.

KEYWORDS? ?HPLC-CAD; Dendrobium huoshanense; Den- drobium officinale; Dendrobium moniliforme; Monosaccha- rides; Disaccharides; Content determination

石斛屬（Dendrobium）是蘭科大屬植物之一[1]，分布極其廣泛。《中國植物志》中記載的石斛藥用品種有近51種[2]，其中安徽霍山境內及其鄰近山區主產的霍山石斛（Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S. J. Cheng）、鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）和細莖石斛（又名銅皮石斛）[Dendrobium moniliforme（L.）Sw.]等3種藥用石斛的臨床價值極高[3]。有研究表明，藥用石斛主要含有糖類[4]、生物堿類[5]、菲類[6]等成分，且糖類成分是該藥材發揮抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、調節血糖、增強免疫等[7-9]功效的重要活性成分，且該類成分的藥理活性與其單糖組成密切相關[1，10-11]。由此可見，測定藥用石斛中糖類成分的含量具有重要意義。目前，關于藥用石斛糖類成分中多糖的含量測定已有較多研究報道，但對于其單糖、雙糖的含量測定研究相對較少。單糖和雙糖是多糖組成的基礎，其中果糖具有養胃、護肝、潤腸、滑腸通便、平衡腸道菌群的活性，有預防便秘、腸炎、腸道癌的功效[12];葡萄糖具有營養、解毒、強心、利尿的作用，是機體所需能量的主要來源，除對肝臟具有保護和解毒作用外，還可加強記憶、刺激鈣質吸收和促進細胞間的溝通[13];蔗糖可以增加機體三磷酸腺苷的合成，有利于維持氨基酸的活力與蛋白質的合成，具有解毒保肝、抑制細菌繁殖、止血、消炎、增強鈣鐵吸收等作用[14];且果糖、葡萄糖和蔗糖混合物具有補血的活性[15]。因此，測定藥材中單糖和雙糖的含量顯得十分重要。

有學者采用高效液相色譜（HPLC）-蒸發光散射法[16]和高效陰離子交換色譜-脈沖安培法[1]測定了藥用石斛中單糖和雙糖的含量，但蒸發光散射檢測的耐用性和穩定性欠佳[17]，脈沖安培檢測的成本較高、穩定性差且對色譜條件要求較為嚴格[18]。近年來，電噴霧式檢測器（CAD）作為一種新型的通用檢測器，可在一定程度上彌補上述檢測器的不足，現已被廣泛應用于藥物分析領域，尤其是脂質、糖類、生物堿類、甾體皂苷類等弱紫外吸收和無紫外吸收化合物的定量分析[19-21];此外，CAD還具有無需衍生化處理就可直接分離以測定單糖、雙糖的優點[22]。基于此，本研究采用HPLC-CAD法測定霍山石斛、鐵皮石斛、銅皮石斛等3種藥用石斛中單糖（果糖、葡萄糖）和雙糖（蔗糖）的含量，以探討不同來源藥用石斛的差異，旨在為霍山石斛、鐵皮石斛、銅皮石斛的鑒別提供依據，亦為藥用石斛的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate-3000型HPLC儀，包括Corona Ultra型電霧式檢測器、Chromeleon 7.1色譜工作站（美國Dionex公司）;Elma S120H型超聲波清洗機（德國Elma公司）;Simplicity-185型超純水儀（美國 Millipore公司）;YF-103型搖擺式6兩裝高速中藥粉碎機（瑞安市永歷制藥機械有限公司）;HH型數顯恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司）;ML204型萬分之一分析天平、XP26 型百萬分之一分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥材

24批藥用石斛藥材（編號：S1～S24）均購自九仙尊霍山石斛股份有限公司，經安徽中醫藥大學藥學院劉守金教授鑒定，S1～S8為霍山石斛（D. huoshanense C. Z.Tang et S. J. Cheng）、S9～S16為鐵皮石斛（D. officinale Kimura et Migo）、S17～S24為銅皮石斛[D. moniliforme（L.）Sw.]的莖。石斛樣品信息來源見表1。

1.3 試劑

果糖對照品（批號：100231-201305，純度：99.7%）、D-無水葡萄糖對照品（批號：110833-201506，純度：99.9%）、蔗糖對照品（批號：111507-201303，純度：99.8%）均由中國食品藥品檢定研究院提供;乙腈為色譜純，乙醇、甲醇等其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流動相：乙腈-水（75 ∶ 25，V/V）;流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;進樣量：10 ?L;檢測器：CAD;數據采集頻率：5 Hz;過濾常數：5 s;霧化器溫度：35 ℃;氣源：氮氣;壓力：4.012×105 Pa。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取果糖對照品390.375 mg、D-無水葡萄糖對照品31.750 mg、蔗糖對照品694.050 mg，分別置于5 mL量瓶中，加80%乙醇溶解并定容，搖勻，制得各單一對照品貯備液。取上述各單一對照品貯備液1 mL，置于25 mL量瓶中，加80%乙醇稀釋至刻度，混勻，制成果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖質量濃度分別為3.123、0.254、5.552 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取藥用石斛藥材樣品粉碎，過三號篩，取粉末，約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加80%乙醇30 mL，超聲（功率：500 W，頻率：30 kHz）處理60 min，濾過，減壓回收溶劑，殘渣加適量80%乙醇溶解，并用80%乙醇定容至10 mL量瓶中，經0.22 ?m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 以80%乙醇為陰性對照溶液。

2.3 系統適用性試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液（以S4、S11、S24為例）、陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖的分離度均大于1.5，理論板數均不低于6 000，陰性對照對測定無干擾，詳見圖1。

2.4 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于 10 mL量瓶中，加80%乙醇稀釋至刻度，制成系列濃度工作溶液。按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分的質量濃度（x，mg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸。結果，果糖的回歸方程為y=44.665 7x-0.474 8（r=0.999 5）、D-無水葡萄糖的回歸方程為y=45.171 8x+0.133 0（r=0.999 7）、蔗糖的回歸方程為y=46.555 3x+0.350 1（r=0.999 8），上述3種成分檢測質量濃度的線性范圍分別為0.156 2～1.873 8、0.012 7～0.152 4、0.277 6～3.331 2 mg/mL。

2.5 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液，用80%乙醇逐級稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，分別以信噪比10 ∶ 1、 3 ∶ 1計算定量限、檢測限。結果，果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖的定量限分別為0.002 61、0.004 24、0.005 12 mg/mL，檢測限分別為0.000 78、0.001 27、0.001 54 mg/mL。

2.6 精密度試驗

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液1.0 mL，置于5 mL量瓶中，加80%乙醇稀釋至刻度，混勻，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖峰面積的RSD分別為1.1%、1.2%、1.0%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S4）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖峰面積的RSD分別為1.3%、1.4%、1.3%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h 內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

精密稱取藥用石斛藥材樣品（編號：S4）粉末約1.0 g，共6份，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品中3種成分的含量。結果，果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖含量的RSD分別為2.0%、1.4%、1.9%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（編號：S4）粉末約0.5 g，共6份，精密稱定，分別精密加入一定量的混合對照品溶液（含果糖3.001 6 mg/mL、D-無水葡萄糖1.303 mg/mL、蔗糖25.809 4 mg/mL）0.5 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

2.10 耐用性試驗

取藥用石斛藥材樣品（編號：S4）粉末適量，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件分別以不同色譜柱[Shodex Asahipak NH2P-50 4E（250 mm×4.6 mm，5 ?m）、Agilent Zorbax NH2（250 mm×4.6 mm，5 ?m）、Phenomenex Luna? NH2（250 mm×4.6 mm，3 ?m）]、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同柱溫（25、30、35 ℃）進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品中3種成分的含量，結果見表3。

2.11 樣品含量測定

取24批藥用石斛藥材樣品粉末適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品中3種成分的含量，結果見表4、圖2。

由圖2、表4可知，3種藥用石斛中糖類成分的含量高低依次為蔗糖>果糖>D-無水葡萄糖，其中蔗糖含量及總含量高低依次均為霍山石斛>銅皮石斛>鐵皮石斛，D-無水葡萄糖含量高低依次為霍山石斛>鐵皮石斛>銅皮石斛，果糖含量高低依次為銅皮石斛>鐵皮石斛>霍山石斛，提示3種石斛中糖類成分的含量存在差異。

3 討論

在前期預試驗中，本課題組分別比較了以5種比例乙腈-水（83 ∶ 17、? 80 ∶ 20、78 ∶ 22、75 ∶ 25、70 ∶ 30，V/V）的分離效果。結果發現，以乙腈-水（75 ∶ 25，V/V）為流動相時所得的色譜峰分離度適宜，峰寬較小、峰高較高，且在20 min內即可達到良好的分離效果，故選擇流動相為乙腈-水（75 ∶ 25，V/V）。同時，本課題組在“耐用性試驗”項下又考察了不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）的分離效果。結果發現，流速的變化對試驗結果影響較小;但當流速為1.0 mL/min時，各色譜峰的分離度良好、峰寬較小，故選擇流速為1.0 mL/min。此外，本課題組在“耐用性試驗”項下還考察了不同柱溫（25、30、35、40 ℃）對色譜峰分離效果的影響。結果發現，柱溫的變化對色譜峰保留時間、峰寬和分離度無明顯影響，考慮到試驗操作的簡便性，最終選擇與試驗環境溫度較為接近的30 ℃為柱溫。

本研究結果顯示，3種藥用石斛中均含有果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖，但3種糖類成分的含量存在差異。3種藥用石斛中單、雙糖類成分總含量以霍山石斛最高，其次為銅皮石斛，鐵皮石斛最低;蔗糖、D-無水葡萄糖的含量以霍山石斛最高，果糖的含量以銅皮石斛最高。其原因可能與藥材的地域多樣性有關，即不同產地及栽培環境均可導致藥用石斛藥材中糖類成分含量存在差異[23]。而本研究中，由于3種藥用石斛的栽培環境不同，可能對植物體內糖類成分的積累和代謝造成不同程度的影響;加之不同品種間的遺傳因素，可能也會影響糖類成分代謝的關鍵酶活性，從而改變糖類成分的積累或降解過程，導致糖類成分含量存在明顯差異[24]。此外，由于3種藥用石斛采集時的生長年限不同，造成了糖類成分在植物體內積累程度不同，從而導致糖類成分含量有所差異[25]。糖類成分的含量能反映石斛藥材的信息，通過分析霍山石斛、鐵皮石斛、銅皮石斛中3種糖類成分含量存在的差異，可進一步區分3種藥用石斛。

綜上所述，本研究所建HPLC-CAD法靈敏度高、重復性好、操作簡單，可用于測定3種藥用石斛中3種糖類成分的含量;3種石斛中糖類成分的含量存在差異。

參考文獻

[ 1 ] 陳懿瑤，羅陽，閆燊，等. HPAEC-PAD法測定石斛屬植物單糖組分與主成分聚類分析[J]. 中國實驗方劑學雜志，2018，24（15）：106-111.

[ 2 ] 中國科學院《中國植物志》編委會.中國植物志：第19冊[M].北京：北京科學出版社，1999：111.

[ 3 ] 劉明珍，陳乃富，李耀亭，等.霍山產3種藥用石斛及其雜交優勢種的ISSR-PCR分子標記鑒別[J].種子，2009，28（2）：43-45.

[ 4 ] 陳云龍，張銘，華允芬，等. 細莖石斛不同部位有效成分及分布規律研究[J].中國中藥雜志，2001，26（10）：709- 710.

[ 5 ] BI ZM，LI Y，WANG ZT，et al. A new bibenzyl derivative from dendrobium moniliforme[J]. Chin Chem Lett，2002，13（6）：535-536.

[ 6 ] LIN TH，CHANG SJ，CHEN CC，et al. Two phenanthraquinones from dendrobium moniliforme[J]. J Nat Prod，2001，64（8）：1084-1086.

[ 7 ] 蔣玉蘭，羅建平.藥用石斛多糖藥理活性及化學結構研究進展[J].時珍國醫國藥，2011，22（12）：2986-2988.

[ 8 ] 孫恒，胡強，金航，等.鐵皮石斛化學成分及藥理活性研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2017，23（11）：225-234.

[ 9 ] 呂圭源，顏美秋，陳素紅.鐵皮石斛功效相關藥理作用研究進展[J].中國中藥雜志，2013，38（4）：28-32.

[10] 黃民權，阮金月. 6種石斛屬植物水溶性多糖的單糖組分分析[J].中國中藥雜志，1997，22（2）：74、115.

[11] 龔慶芳，周浩，王新桂，等. 7種石斛多糖質量分數的測定及單糖組成分析[J].食品科技，2013，38（3）：180-183.

[12] 劉宗利，李克文，王京博，等.低聚果糖的理化特性、生理功效及其應用[J].中國食品添加劑，2016，211（10）：211-215.

[13] 宋玉民，周清濤，帥斌，等.功能糖研究進展[J].精細與專用化學品，2013，21（11）：29-31.

[14] 李偉.功能性低聚糖的酶法合成及其生理功能評價[D].南京：南京農業大學，2010.

[15] 梁乾德.用化學組學方法研究四物湯的補血成分[D].北京：中國人民解放軍軍事醫學科學院，2003.

[16] 張淋潔，王如偉，何厚洪，等.高效液相色譜-蒸發光散射法測定鐵皮石斛中單糖和雙糖[J].醫藥導報，2013，32（4）：517-520.

[17] 孫亞靈，趙恂，張玫，等.蔗糖及其有關物質含量的HPLC-CAD分析研究[J]. 藥物分析雜志，2019，39（4）：32-38.

[18] 孫亞飛，趙恂，張玫，等. HPLC-CAD法測定乳糖含量及有關物質[J].藥物分析雜志，2018，38（5）：168-175.

[19] 劉路，高旋，楊永健. HPLC-電霧式檢測器的應用[J].中國醫藥工業雜志，2012，43（3）：227-231.

[20] 李心怡，蔣運斌，馬逾英.電噴霧檢測器在藥物HPLC分析中的優勢及應用進展[J].中國藥房，2017，28（15）：2152-2155.

[21] 劉立洋，劉肖. 1種新型的通用型檢測器：電噴霧檢測器[J].現代科學儀器，2011（5）：144-148.

[22] 張雪，李錚，張英濤，等. HPLC-CAD法同時測定白及中單糖、雙糖的含量[J].國際藥學研究雜志，2018，45（2）：154-157.

[23] 鄧輝，韓邦興，陳乃東，等.安徽霍山產3種石斛多糖組成的比較研究[J].中藥材，2017，40（6）：65-69.

[24] 孟雨冉.鐵皮石斛多糖積累與蔗糖代謝的影響因素研究[D].杭州：浙江農林大學，2018.

[25] 秦子芳，譚曉妍，寧慧娟，等.不同生長年限鐵皮石斛多糖含量與特性分析[J].食品科學，2018，39（6）：189-193.

（收稿日期：2019-12-10 修回日期：2020-03-31）

（編輯：陳 宏）