超高效液相色譜法測定忍冬葉中5種黃酮成分

馬艷妮　李智寧　王韜　王志堯　魏悅　張海艷

摘要：通過超高效液相色譜-二極管陣列檢測法（ultra performance liquid chromatography-diode array detector，簡稱UPLC-DAD）測定忍冬葉中蕓香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆樹苷、木犀草素5種黃酮類成分的含量。使用Agilent Elipse plus C18反向色譜柱（4.6 mm 100 mm，3.5 m），用乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）進行梯度洗脫（0～20 min，14%A;20～50 min，14%～17%A;50～60 min，17%～32% A;60～61 min，32%～90%A），流速為0.5 mL/min，進樣體積為4 L，柱溫為30 ℃，檢測波長為350 nm。結果表明，蕓香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆樹苷、木犀草素分別在0.28～27.68、0.43～43.28、0.80～53.27、0.27～27.48、0.16～16.46 μg/mL時與其峰面積呈良好的線性關系，平均回收率分別為97.39%、99.03%、99.19%、98.88%、97.03%，相對標準偏差（RSD）分別為0.96%、0.27%、0.88%、0.64%、1.39%，說明儀器的精密度及方法的重復性均良好，符合定量測定的要求。綜合研究結果得出，該方法操作簡單、分離效果好、靈敏度高，可為忍冬葉的開發利用和質量控制提供方法學基礎。

關鍵詞：：忍冬葉;黃酮;超高效液相-二極管陣列檢測法;質量控制

中圖分類號：R284文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）07-0226-04

藥用植物忍冬有花（金銀花）、藤（忍冬藤）兩大藥用部位，其中金銀花具有清熱解毒、疏散風熱的功效，忍冬藤具有清熱解毒、疏風通絡的功效。研究發現，作為非藥用部位的忍冬葉，同樣具有抗菌、抗炎、抗氧化等多種生物活性[1-2]。研究還發現，忍冬葉中含有有機酸、黃酮和環烯醚萜苷等多類活性成分[3-4]，并且其綠原酸含量接近金銀花，有時甚至高于金銀花[5];忍冬葉中的黃酮含量則明顯高于金銀花和忍冬藤[6-8]。結合忍冬葉高產量、低價格的特點[9]來開發利用忍冬葉具有巨大的經濟意義和社會效益。

2015年版《中華人民共和國藥典》中規定，綠原酸和木犀草苷為金銀花的含量控制指標[10]，可以參照此標準對忍冬葉進行質量控制，但是由于指標成分略顯單一，難以全面衡量忍冬葉的質量。關于忍冬葉成分含量檢測的報道較多[11-13]，并且目前的研究已經具有同時測定多種活性成分的優勢。本試驗首次建立了用超高效液相色譜-二極管陣列檢測法（ultra performance liquid chromatography-diode array detector，簡稱UPLC-DAD）同時測定忍冬葉中蕓香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆樹苷及木犀草素5種黃酮類活性成分的檢測方法，以期為忍冬葉的開發利用和多指標質量控制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器、試劑與材料

1.1.1 儀器 Agilent超高效液相色譜儀（型號6400，配備自動進樣器、四元梯度泵和二極管陣列檢測器）;分析天平（型號為AUW220D），購自SHIMADZU公司。

1.1.2 藥品與試劑 對照品蕓香苷（純度為91.9%，批號為100080-201409），購自中國食品藥品檢定研究院;木犀草苷（純度≥98%，批號為MUST-13060908），購自成都曼斯特生物科技有限公司;野漆樹苷（純度≥98%，批號為wkq916021802）、木犀草素（純度≥98%，批號為wkq916051201）和忍冬苷（純度≥98%，批號為wkq18072701），均購自四川省維克奇生物科技有限公司;甲醇、乙腈、甲酸均為色譜級試劑，購自Thermo Fisher公司。

1.1.3 試驗樣品 6批忍冬葉采自河南省的不同地區，經河南中醫藥大學陳隨清教授鑒定，這些樣品均為忍冬科忍冬屬忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥葉片，標本存放于河南省科學院天然產物重點實驗室，標本編號依次為150503、170504、170505、170506、170507、170708。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的制備

1.2.1.1 對照品溶液的制備 分別精確稱取適量蕓香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆樹苷、木犀草素對照品，并分別置于5個25 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容，分別制成質量濃度為276.80、226.38、532.68、274.79、164.64 μg/mL的對照品儲備液。于4 ℃儲存、備用。

1.2.1.2 供試品溶液的制備 精確稱取約0.15 g忍冬葉粉末，過三號篩，置于25 mL棕色量瓶中，加約24 mL色譜級甲醇，超聲處理1 h，自然冷卻后用甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾，取續濾液，即得供試品溶液。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為Agilent Elipse Plus C18柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，14% A;20～50 min，14%～17% A;50～60 min，17%～32% A;60～61 min，32%～90% A），流速為0.5 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為350 nm，進樣體積為4 μL。

1.2.3 方法學考察

1.2.3.1 線性關系、檢出限及定量限[14]的考察 精確吸取各2.5 mL蕓香苷、忍冬苷、野漆樹苷、木犀草素對照品溶液及5 mL木犀草苷對照品溶液，置于25 mL棕色量瓶中，用含量≥99.5%的甲醇溶液溶解，定容，制成蕓香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆樹苷、木犀草素質量濃度分別為27.68、45.28、53.27、27.48、16.46 μg/mL的混合對照品溶液。分別吸取2、1.6、1.2、0.8、0.4、0.1、0.05、0.02 mL混合對照品溶液置于2 mL棕色量瓶中，用甲醇定容。按照“1.2.2”節的色譜條件進行測定，以質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸分析，并計算各對照品的檢出限[信噪比（S/N）=3 ∶1]和定量限（S/N=10 ∶1）。

1.2.3.2 精密度試驗 取適量稀釋后的混合對照品溶液，按照“1.2.2”節的色譜條件進行檢測，連續進樣6次，記錄各峰面積。

1.2.3.3 重復性試驗 取任一忍冬葉樣品6份，按照“1.2.1.2”節的方法制備6份供試品溶液，按照“1.2.2”節的色譜條件進行檢測，記錄各峰面積。

1.2.3.4 穩定性試驗 取任一忍冬葉的同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24、48、72 h進樣，記錄各峰面積。

1.2.3.5 加樣回收率試驗 精確稱取9份已知黃酮含量的忍冬葉樣品，隨機分為3組，分別加入高、中、低3個濃度的蕓香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆樹苷、木犀草素對照品溶液，先按照“1.2.1.2”節的方法制備9份供試品溶液，再按照“1.2.2”節的色譜條件進行檢測，計錄各峰面積，計算回收率及相對標準偏差（RSD）。

1.2.4 樣品測定與數據分析 取不同產地或批次的忍冬葉，按照“1.2.1.2”節的方法分別平行制備3份供試品溶液，按照“1.2.2”節的色譜條件進行檢測。根據不同樣品檢測結果中各個化合物的峰面積，用線性方程計算出所檢測溶液中各個化合物的濃度，再結合檢測過程中稀釋倍數等其他因素，最終求得待測樣品中各個化合物的含量。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

依據“1.2.3.1”節的不同對照品溶液濃度對檢測結果進行線性回歸，得到5種待測黃酮化合物的回歸方程，并計算其檢出限與定量限，結果見表1。

2.2 方法學考察結果

2.2.1 精密度試驗 通過計算得出，標準品溶液中蕓香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆樹苷、木犀草素峰面積的RSD（n=6）分別為1.12%、0.70%、0.78%、0.76%、0.73%，表明儀器的精密度良好，符合定量測定要求。

2.2.2 重復性試驗 取6份忍冬葉170708樣品，制成供試品溶液后進行檢測，計算得出蕓香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆樹苷、木犀草素含量分別為406.7、1 475.0、7 060.4、577.6、174.0 μg/g，RSD（n=6）分別為2.89%、1.88%、2.87%、1.15%、2.33%。說明該方法的重復性良好，符合定量測定的要求。

2.2.3 穩定性試驗 取忍冬葉170708的同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24、48、72 h進樣，計算得出， 蕓香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆樹苷、木犀草素含量的RSD（n=7）分別為0.98%、1.24%、0.69%、1.20%、0.33%，表明所測5種黃酮成分在72 h內的穩定性良好。

2.2.4 加樣回收率試驗 精確稱取9份已知含量的忍冬葉樣品（忍冬葉170708），隨機分為3組后，在每組中分別加入高、中、低3個濃度的混合對照品溶液，制成9份供試品溶液后進行檢測。由表2可以看出，該檢測方法的準確度較高。

2.3 樣品測定結果

6份不同產地或批次的忍冬葉的液相色譜結果見圖1，計算結果見表3。可以看出，忍冬葉中這5種黃酮含量差別較大，其中蕓香苷和木犀草素的含量較低，木犀草苷、忍冬苷和野漆樹苷的含量較高，而且不同產地的每種黃酮成分的含量差異也較大。

3 討論與結論

在對流動相體系進行篩選的過程中[15-16]，筆者先后考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水溶液4種體系，結果表明，乙腈-0.1%甲酸水溶液體系下的色譜峰分離度較好，基線也較穩定。采用二極管陣列檢測器對5個黃酮成分在波長為190～400 nm的范圍內進行掃描，發現蕓香苷分別在256、353 nm處有最大、較大吸收，而木犀草苷、忍冬苷、野漆樹苷、木犀草素依次在347、350、340、350 nm處有最大吸收。分析比較得出，在350 nm波長下得到的色譜峰較好且檢測結果穩定，因此統一選擇350 nm作為檢測波長。對提取溶劑（甲醇、50%甲醇、70%乙醇）的考察結果表明，用甲醇超聲提取1 h后，待測化合物的色譜峰響應值相對較大。

對忍冬葉中5種黃酮類成分（蕓香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆樹苷和木犀草素）含量的測定結果顯示，不同產地或批次的忍冬葉中5種黃酮類成分含量不一。總體來說，木犀草苷和忍冬苷的含量相對較高，蕓香苷和木犀草素的含量相對較低。本檢測方法操作簡單，分離效果好，靈敏度高，重現性好，可以為忍冬葉的進一步開發利用及質量控制提供試驗依據。

參考文獻：

[1]馬俊利，商克勇，周艷紅. 忍冬葉總黃酮對四氯化碳致急性肝損傷小鼠的保護作用[J]. 中國實驗方劑學雜志，2012，18（24）：304-307.

[2]馬艷妮，王志堯，郭展展，等. 忍冬葉總黃酮的測定及其體外抗菌活性[J]. 中國實驗方劑學雜志，2017，23（6）：55-59.

[3]陳 玲，張海艷，李 曉，等. 忍冬的化學成分研究進展[J]. 現代藥物與臨床，2015，30（1）：108-114.

[4]朱 姮，陳靜嫻，文 蕾，等. 忍冬葉化學成分的研究進展[J]. 山東科學，2016，29（6）：30-39.

[5]郭 玉，陽育聰，劉運美，等. 金銀花及其葉中有效成分的比較研究[J]. 南華大學學報（醫學版），2008，36（2）：154-157.

[6]石雨荷，謝舒平，王麗君，等. 高效液相色譜法同時測定湖南不同產地金銀花中不同部位綠原酸與木犀草苷含量[J]. 中南藥學，2019，17（4）：552-555.

[7]王 柯，王艷艷，趙東保，等. HPLC法測定金銀花不同部位中木犀草素及其苷的含量[J]. 河南大學學報（自然科學版），2011，41（1）：39-43.

[8][JP3]范 毅，陳 玲，李 曉，等. 不同產地金銀花提取物的指紋圖譜及綠原酸、木犀草苷含量測定[J]. 河南科學，2019，37（1）：53-59.

[9]羅 磊，張冰潔，朱文學，等. 響應面試驗優化超聲輔助提取金銀花葉黃酮工藝及其抗氧化活性研究[J]. 食品科學，2016，37（6）：13-19.

[10]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（一部）[M]. 北京：中國醫藥科技出版社，2015：221.

[11]錢正明，李會軍，李 萍，等. 高效液相色譜法測定忍冬藤和葉中8種活性成分[J]. 分析化學，2007，35（8）：1159-1163.

[12]朱金花，王悠悠，慶偉霞，等. HPLC法同時測定忍冬葉中9種活性成分的研究[J]. 化學研究，2017，28（1）：70-74.

[13]田 偉，范帥帥，甄亞欽，等. UPLC比較金銀花、忍冬藤和忍冬葉中11種活性成分的含量[J]. 中國中藥雜志，2019，44（1）：100-105.

[14]Gao W，Wang R，Li D，et al. Comparison of five Lonicera flowers by simultaneous determination of multi-components with single reference standard method and principal component analysis[J]. Journal of Pharmaceutical Biomedical Analysis，2016，117（1）：345-351.

[15]李 正，吳德玲，趙宏蘇，等. UPLC測定醉魚草不同部位中4種黃酮類成分[J]. 中國實驗方劑學雜志，2017，23（6）：74-77.

[16]Ren M T，Chen J，Song Y，et al. Identification and quantification of 32 bioactive compounds in Lonicera species by high performance liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry[J]. Journal of Pharmaceutical Biomedical Analysis，2008，48（5）：1351-1360.