miR-133靶向NLRP3對小鼠Kupffer細胞炎性活化的影響*

徐秀亮， 楊江華， 盛皓宇， 梁曼曼， 陳 聰， 魯 稻， 江啟貴

（1池州市人民醫院感染科，安徽池州247000；2皖南醫學院附屬弋磯山醫院感染病科，安徽蕪湖241001）

庫普弗細胞（Kupffer cells，KCs）是肝臟中介導炎癥反應的單核-巨噬細胞群，可吞噬異物，可生成炎癥因子導致肝細胞損傷，其持續激活可促使非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）等發生［1］。而NAFLD可誘發肝臟脂肪變性和脂肪纖維化，最終導致肝硬化和肝癌，危害嚴重［2］。因此，減輕KCs介導的肝損傷可緩解疾病。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）參與炎癥、肝細胞損傷和肝纖維化等過程［3］，肝損傷和肝纖維化的乙型肝炎肝組織中miR-133高表達可能會介導慢性炎癥影響疾病進程［4］，但miR-133在KCs中的作用尚未見報道。本研究通過分離小鼠KCs，并經脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導，探究 miR-133在KCs炎性活化中的作用。

材料和方法

1 動物

清潔級BALB/c小鼠，雄性，6～9周，體重（15～22）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為SCXK（京）2017-0021，飼養條件：溫度（21±1）℃、濕度（50±10）%，光照/黑暗（12 h/12 h），自由飲水飲食。

本實驗經池州市人民醫院動物倫理委員會審核并批準。

2 藥品、試劑及儀器

LPS（貨號為 L4391-1MG）購自 Sigma；miR-133 inhibitor NC、miR-133 inhibitor、miR-133 mimic NC、miR-133 mimic、Lipofectamine 2000、核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）3′UTR-WT和NLRP3 3′UTR-MUT均由廣州銳博生物設計并合成；引物由上海生工生物有限公司合成。TIANscript RT Kit（貨號為 KR104）和 miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit（貨號為KR211）購自北京天根生化科技有限公司；小鼠白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、兔抗鼠NLRP3抗體、兔抗鼠含胱天蛋白酶募集結構域的凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）抗體、兔抗鼠caspase-1抗體和兔抗鼠GADPH抗體均購自Abcam，貨 號 分 別 為 ab9722、ab1793、ab214185、ab175449、ab1872和ab181602；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（貨號為D0010）由北京索萊寶科技有限公司生產。

實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀由ABI生產，型號為7500；全自動凝膠成像分析系統購自深圳市三利化學有限公司，型號為ZF-388。

3 方法

3.1 小鼠肝臟KCs的分離和培養 實驗前DMEM培養液添加10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素混勻，置于4℃冰箱中制成DMEM完全培養液待用。采用膠原酶原位灌注加雙層梯度離心法獲得小鼠KCs［5］：麻醉小鼠分離消化肝臟，200目濾網過濾后加100μL PBS稀釋，1∶1加50%等滲Percoll溶液（stock isotonic Percoll，SIP）制成25%SIP，150×g離心15 min，分層由上往下為細胞碎片層、25%SIP層、KCs層、50%SIP層和其它層，小心吸取KCs置于新的EP管中，PBS稀釋，1 200 r/min離心5 min，沉淀為KCs。KCs置于DMEM完全培養液中，在37℃、CO2培養箱培養，細胞分離6 h后加碳素墨水（終體積分數為0.5%）再培養1 h，于顯微鏡下觀察細胞吞噬情況。

3.2 細胞分組 將經鑒定正確的細胞培養至對數生長期，分為正常（control）組、模型（model）組、miR-133 inhibitor對照（miR-133 inhibitor NC）組、miR-133 inhibitor組、miR-133 mimic對照（miR-133 mimic NC）組和miR-133 mimic組。除正常組外，其余各組添加1 mg/L LPS誘導［6］，各組參照Lipofectamine 2000說明書分別轉染miR-133 inhibitor NC、miR-133 inhibitor、miR-133 mimic NC和miR-133 mimic，培養24 h鑒定各組細胞中miR-133水平。

3.3 RT-qPCR法檢測細胞中miR-133和NLRP3的mRNA水平 細胞培養24 h后，RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit、TIANscript RT Kit將其逆轉錄成第1鏈cDNA。miR-133的上游引物序列為5'-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA-3′，下游引物序列為5'-GGTGGCTTATGTTTGTAATCCC-3′；U6的上游引物序列為5'-ATATGGACGCTTCAATT-3′，下游引物序列為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；NLRP3的上游引物序列為 5'-GACCATCGGCCGGACTAAAA-3′，下游引物 序 列 為 5'-CTTGCACACTGGTGGGTTTG-3′；GAPDH的上游引物序列為5'-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，下 游 引 物 序 列 為 5'-CCCTAGGCCCCTCCTGTTAT-3′。RT-qPCR 體系：10 μL 2×SYBR qPCR Mix，1 μL cDNA（40 ng/L），上、下游引物（10μmol/L）各0.5μL，8μL ddH2O。反應條件：94℃120 s；95℃ 40 s，62℃ 35 s，共 45 個循環。2-ΔΔCt法計算miR-133和NLRP3相對表達水平。

3.4 ELISA檢測細胞培養液中炎癥因子IL-1β和TNF-α水平 鑒定成功各組細胞，收集細胞培養液，300×g離心5 min收集上清，分裝置于4℃冰箱待用。嚴格按照小鼠IL-1β和TNF-αELISA試劑盒說明書檢測上清液中IL-1β和TNF-α水平。

3.5 Westerm blot實驗檢測細胞中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白水平 按3.2培養細胞并鑒定成功，每孔加200μL蛋白裂解液冰上裂解15 min，10 000×g離心20 min，上清為總蛋白。凝膠電泳分離蛋白質后轉膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；加入各種Ⅰ抗（抗NLRP3、ASC、caspase-1和GADPH抗體），4℃孵育過夜；加入相應Ⅱ抗，室溫孵育1 h。DAB顯色試劑盒避光顯色，全自動凝膠成像分析系統拍照和定量分析。

3.6 雙螢光素酶鑒定miR-133與NLRP3的靶向關系 用TargetScan查找NLRP3 mRNA的3′-UTR與miR-133結合位點。設計合成NLRP3的3′UTR-WT和 3′UTR-MUT，分別與 miR-133 mimic 或 miR-133 mimic NC共轉染，雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組螢光素酶相對活性。

4 統計學處理

采用統計學軟件GraphPad Prism 8.0進行數據分析，計量數據以平均數±標準差（mean±SD）描述，兩兩比較采用SNK-q法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 LPS對KCs的影響

培養4 h的KCs呈圓形，細胞邊緣有較強的折光現象；隨著培養時間的延長，培養至24 h時KCs呈星形，細胞開始向周圍伸展；培養至72 h時KCs呈長梭形，體積較24 h時較大，邊界清晰，見圖1A。細胞中可見大量黑色顆粒，該顆粒是添加碳素墨水后的碳顆粒，證明該細胞具有較強的吞噬功能，該細胞即為KCs，見圖1B。與正常組相比，模型組細胞中miR-133水平降低（P＜0.05）；與模型組、miR-133 inhibitor對照組和miR-133 mimic對照組相比，miR-133 inhibitor組細胞中miR-133水平降低（P＜0.05），miR-133 mimic組細胞中miR-133水平升高（P＜0.05），見圖1C。

2 miR-133在LPS作用于KCs后對炎癥的影響

與正常組相比，模型組細胞中NLRP3 mRNA水平、培養液中IL-1β和TNF-α水平及NLRP3和caspase-1蛋白水平升高（P＜0.05）；與模型組、miR-133 inhibitor對照組和miR-133 mimic對照組相比，miR-133 inhibitor組細胞中NLRP3 mRNA水平、培養液中IL-1β和TNF-α水平及NLRP3和caspase-1蛋白水平升高（P＜0.05），miR-133 mimic組細胞中 NLRP3 mRNA水平、培養液中IL-1β和TNF-α水平及NLRP3和caspase-1蛋白水平降低（P＜0.05），見圖2。

3 雙螢光素酶驗證miR-133與NLRP3的靶位點

TargetScan分析發現，NLRP3 mRNA 的 3′-UTR含有miR-133序列保守堿基。螢光素酶實驗結果顯示，與 miR-133 mimic NC+3′UTR-WT 組相比，miR-133 mimic+3′UTR-WT組細胞螢光素酶相對活性下降（P＜0.05），見圖3。

討 論

Figure 1.Influence of LPSon KCS.A：the shape of KCs（scale bar=100μm）；B：identification of KCs（scale bar=50μm；black arrows indicate carbon particles）；C：expression level of miR-133 in cells of each group.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs miR-133 inhibitor NCgroup；□P＜0.05 vs miR-133 mimic NCgroup.圖1 LPS對KCs的影響

miRNA靶向mRNA參與炎癥反應應用廣泛，可直接降解靶基因mRNA或抑制靶基因翻譯實現轉錄后的基因沉默［7-9］，其中miR-133屬常見miRNA，包括miR-133a和miR-133b兩個成員，miR-133a在肝纖維化中具有抗纖維化作用，對肝臟起保護作用［10］；在炎癥誘導的大腸癌中表達下調，可能參與從腸道炎癥到癌變過程［11］。miR-133b在肝癌中水平降低，在肝損傷期間產生新的肝細胞反應中起著作用［12］；在變應性鼻炎小鼠鼻粘膜中表達下調，上調miR-133b通過靶向NLRP3可改善鼻摩擦、打噴嚏的頻率以及細胞因子TNF-α、IL-4、IL-5和IFN-γ水平從而緩解變應性炎癥和過敏癥狀［13］。推測miR-133影響疾病發生。本研究顯示，與正常組相比，模型組細胞中miR-133水平降低，提示miR-133在LPS誘導的KCs炎癥中表達下調，可能參與NAFLD炎癥及肝損傷過程，但其具體機制尚不清楚。與miR-133 inhibitor對照組相比，miR-133 inhibitor組細胞中miR-133水平降低；與miR-133 mimic對照組相比，miR-133 mimic組細胞中miR-133水平升高，本研究miR-133轉染成功。miR-133轉染情況不同，可能影響靶基因表達從而影響參與疾病反應。

NLRP3屬目前研究較多的炎癥小體，NLRP3炎癥小體激活誘導肝臟炎癥和纖維化的介質［14-15］，在LPS誘導的小鼠炎癥性肝損傷中抑制NLRP3表達可降低肝臟中IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α水平，緩解炎癥，減輕肝損傷［16］。本研究顯示，與對照組相比，模型組細胞中NLRP3 mRNA和蛋白水平升高，提示LPS誘導可激活NLRP3，活化后的NLRP3發揮致炎作用。進一步研究TargetScan預測檢測到NLRP3 mRNA的3′UTR含有miR-133序列保守堿基，螢光素酶實驗驗證miR-133與NLRP3存在直接靶向結合位點，miR-133可通過直接靶向NLRP3而發揮作用。NLRP3激活后募集ASC并活化caspase-1，進而發揮致炎作用［17］。caspase-1可促進分泌IL-1β和TNF-α的分泌，從而加重炎癥反應［18］。IL-1β在NAFLD中高表達，高水平IL-1β可增加NAFLD實質損害和脂肪性肝炎［19］；抑制TNF-α可改善NAFLD腸道微生態系統，可能導致調節血糖，脂質代謝和保護肝臟免受NAFLD損害［20］。本研究表明，與對照組相比，模型組細胞中caspase-1蛋白水平及細胞培養液中IL-1β和TNF-α水平升高，炎癥反應劇烈；降低miR-133水平可激活NLRP3，增加caspase-1活化，加重炎癥反應；升高miR-133水平則降低炎癥因子IL-1β和TNF-α各水平，減弱炎癥反應，實現對KCs的保護。

綜上所述，miR-133在KCs炎癥活化中低表達，增加miR-133水平可通過靶向NLRP3減輕小鼠KCs炎癥，實現對KCs的保護作用。本文首次證實miR-133在LPS誘導的KCs中低表達，高表達miR-133可通過靶向NLRP3發揮抑制炎癥作用。但本文只在細胞水平上初步探討miR-133在KCs中的作用情況，是否對臨床是否有意義尚需深入研究。

Figure 2.The effect of miR-133 on inflammation of KCs after LPSinduction.A：the mRNA expression level of NLRP3 in cells of each group；B：the levels of IL-1β and TNF-α in cell culture medium of each group；C：the protein levels of NLRP3，ASC and caspase-1 in each group.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs miR-133 inhibitor NCgroup；□P＜0.05 vs miR-133 mimic NCgroup.圖2 miR-133在LPS作用于KCs后對炎癥的影響

Figure 3.Target relationship verification between miR-133 and NLRP3.A：TargetScan prediction results；B：luciferase experimental verification results.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs miR-133 mimic NC+3′UTR-WTgroup.圖3 miR-133與NLRP3的靶向關系驗證