養精種玉湯對小鼠卵母細胞體外成熟及PDGFA和PDGFRα表達的影響*

肖彩仙， 段 恒， 唐立明

（重慶醫科大學中醫藥學院，重慶400016）

近年來，由于生活方式和社會環境的改變，晚婚晚育者、卵巢功能不全者和腫瘤年輕患者等增多，不孕癥患者比例逐年上升［1］。卵母細胞體外成熟（in vitro maturation，IVM）成為治療不孕癥的一種潛在有效的方法［2］。目前，全世界應用IVM技術誕生的試管嬰兒有5 000多名，中國也廣泛應用該技術治療多囊卵巢綜合征的不孕患者［3-4］。盡管IVM實踐有了很大發展，但仍然存在成熟率低、穩定性差等問題，不能得到全面推廣［5］。中藥可用于輔助生殖，減輕卵巢過度刺激綜合征，改善卵泡發育和卵子質量［6］。養精種玉湯（Yangjing-Zhongyu decoctin，YZD）為治療不孕癥的經典名方，臨床和動物實驗研究顯示，養精種玉湯可以治療女性不孕，提高卵母細胞成熟率［7-8］。

血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）家族的成員是由4種不同基因編碼的4種不同多肽鏈（A、B、C和D）組成的二聚糖蛋白，這些多肽鏈合成時為無活性前體，在蛋白水解加工后，4個PDGF鏈通過同源二聚化或異二聚化組裝成二硫鍵連接的二聚體，產生5種不同的二聚體同種型：PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC和PDGFDD［9］。有研究顯示，PDGF的A亞基（PDGF subunit A，PDGFA）和 PDGF受 體 α（PDGF receptorα，PDGFRα）在卵母細胞中表達，向培養基中添加PDGF可以促進原始卵泡的發育，而PDGFRα基因的突變則會導致小鼠卵巢變小，進而影響卵母細胞的成熟［10-12］。因此，本研究觀察養精種玉湯對小鼠卵母細胞體外成熟的影響，并進一步觀察養精種玉湯對小鼠卵母細胞體外成熟PDGFA和PDGFRα表達的影響，探討PDGFA和PDGFRα對小鼠卵母細胞體外成熟的作用機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 SPF級雌性KM小鼠140只，8～10周齡，體質量25～30 g，SPF級雄性KM小鼠12只，12周齡，體質量30～35 g，均由重慶醫科大學動物實驗中心提供，許可證號為SYXK（渝）2018-0003。

1.2 藥物和試劑 養精種玉湯含熟地90 g、當歸45 g、白芍45 g和山萸肉45 g，購自重慶桐君閣大藥房，經重慶醫科大學中醫藥學院中藥教研室制備成含生藥1.5 kg/L的浸膏；由費耀教授根據2015版《中國藥典》鑒定為正品，生產批號為20181102。注射用尿促卵泡激素（follicle stimulating hormone，FSH；麗珠制藥廠，生產批號H20052130）；孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG；浙江寧波三生藥業有限公司，生產批號110044564）；胎牛血清（Biological Industries，04-400-1B）；M199培養基（Gibco，12340030）；抗PDGFA抗體（Affinity，AF5179）；抗PDGFRα抗體（Affinity，AF0241）；抗 β-actin抗體（CST，4970T）；goat anti-rabbit IgG（博奧森，0295G）；RNA提取試劑盒（Axygen，AP-MN-MS-RNA-50）；逆轉錄試劑盒（Bimake，B24403）。

1.3 儀器 CO2細胞培養箱（Thermo）；XTL-400型體視顯微鏡（重慶澳浦光電技術有限公司）；Synergy HTX全自動酶標儀和CFX PCR檢測系統（Bio-Rad）；Odyssey Fc雙色紅外熒光成像系統（LI-COR Biosciences）；NanoDrop 2000超微量核酸測定儀（Thermo）。

2 方法

2.1 養精種玉湯血清的制備 將16只雌性小鼠按隨機數字表法分為對照組和養精種玉湯組，每組各8只，按20 g/kg劑量灌胃給藥，正常組給等體積的生理鹽水，每天1次，連續3 d。我們前期采用高效液相色譜監測養精種玉湯的最佳取血時點，發現養精種玉湯灌胃后0.5 h達最高藥物吸收峰值，因此我們選擇末次給藥0.5 h后摘眼球取血。常溫下靜置2 h，4℃、3 000 r/min離心15 min，0.22μm微孔濾膜過濾除菌后分裝，于-80℃冷藏備用。

2.2 小鼠卵母細胞的采集與分組 小鼠處死前46～48 h腹腔注射10 U PMSG，每只0.1 mL，無菌打開腹腔，取出卵巢，清洗3次。在解剖鏡下，用1 mL注射針頭刺破卵巢中的卵泡，用巴氏吸管收集未成熟的卵母細胞-顆粒細胞復合體（oocyte-granulosa cell complexes，OCCs），反復清洗4次，將多只小鼠OCCs混合后分為空白（blank）組、空白血清（blank serum）組、養精種玉湯血清（YZD）組和FSH組。將各組分別放入加有10%胎牛血清的M199培養液中，空白血清組、養精種玉湯血清組和FSH組分別加入2%的小鼠血清、養精種玉湯小鼠血清和75 U FSH。放入37℃、5%CO2的培養箱中培養。

2.3 卵母細胞成熟率的計算 OCCs體外培養24 h后，用透明質酸酶消化去除顆粒細胞，在顯微鏡下觀察并計算各組卵母細胞成熟率（成熟卵母細胞個數/卵母細胞總數×100%），有第1極體排出為成熟卵母細胞。

2.4 小鼠體外受精率及卵裂率的計算 雄性小鼠處死后取出附睪及附睪尾，PBS清洗3次，剪成段，釋出精子于含10%胎牛血清的培養液中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養1～2 h使精子獲能。將培養24 h的各組OCCs用透明質酸酶消化去除顆粒細胞，調整精子密度，按精卵約為10 000∶1的比例將精子加入含有卵母細胞的培養液中繼續孵育5 h。顯微鏡下觀察并計算卵母細胞的受精率（受精卵個數/成熟卵個數×100%），出現兩個原核的細胞為受精卵；24 h后計算卵裂率（卵裂球個數/受精卵數×100%）。

2.5 Western blot檢測PDGFA和PDGFRα蛋白的表達 每組收集20只KM小鼠的OCCs，培養24 h后去除顆粒細胞。各組卵母細胞于4℃、5 000 r/min離心5 min，棄上清，加入裂解液，超聲破碎細胞，提取總蛋白。采用10%的預制凝膠，140 V電泳，待溴酚藍至凝膠底部結束電泳；300 mA轉膜60 min，室溫封閉1.5 h；加入I抗［抗PDGFA（1∶500）和抗PDGFRα（1∶1 000）］4℃過夜；II抗（1∶5 000）室溫搖床孵育1.5 h；配制ECL發光液，暗室中曝光2 min；用ImageJ軟件對目的條帶進行灰度分析，以β-actin為內參照進行比對。

2.6 real-time PCR檢測PDGFA和PDGFRα的mRNA表達水平 每組收集6只小鼠的OCCs，培養24 h后去除顆粒細胞，每組卵母細胞加入Buffer RⅠ，用21號注射器反復抽吸10次，轉入1.5 mL離心管，然后加入Buffer RⅡ，渦漩振蕩，離心，取上清加入異丙醇，混勻。將上述液體移入離心柱內芯，離心，棄濾液，加Buffer W1A，離心，棄濾液，加Buffer W2清洗2次，離心，棄濾液。將離心柱芯轉移到1.5 mL離心管，加入Buffer TE，室溫靜置1 min，離心洗脫得RNA。反應條件為：逆轉錄42℃15 min，85℃2 min；預變性95℃ 30 s；擴增95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環；熔解曲線95℃ 5 s，60℃ 1 min。以GAPDH為內參照，統計分析PDGFA和PDGFRα的mRNA表達。引物信息見表1。

3 統計學處理

用軟件SPSS17.0進行數據分析。率的比較用χ2檢驗；蛋白和mRNA表達的數據表示為均數±標準差（mean±SD），組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 real-time PCR實驗的引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

結 果

1 養精種玉湯對小鼠卵母細胞體外成熟的影響

與空白組和空白血清組比較，養精種玉湯血清組小鼠卵母細胞成熟率顯著提高（P＜0.01）；與FSH組比較，養精種玉湯血清組卵母細胞成熟率的差異無統計學顯著性（P＞0.05），見圖1及表2。這說明養精種玉湯能提高卵母細胞的體外成熟率。

Figure 1.Immature oocytes of each group were cultured in vitro for 24 h（×100）.圖1 各組未成熟卵母細胞體外培養24 h的形態變化

表2 養精種玉湯對小鼠卵母細胞體外成熟的影響Table 2.Effect of YZDon in vitro maturation of mouse oocytes

2 養精種玉湯對小鼠體外受精和受精卵發育的影響

與空白組比較，養精種玉湯血清組受精率明顯提高（P＜0.05）；與空白血清組比較，養精種玉湯血清組受精率的差異無統計學顯著性（P＞0.05），但受精率較空白血清組提高，見表3。這提示養精種玉湯能提高卵母細胞受精率。

3 養精種玉湯對PDGFA和PDGFRα蛋白表達的影響

表3 養精種玉湯血清對小鼠體外受精和受精卵發育的影響Table 3.The effect of YZDon in vitro fertilization and fertilized egg development in mice

Western blot結果顯示，與空白組和空白組血清組比較，養精種玉湯血清組PDGFA和PDGFRα蛋白的表達減少（P＜0.01），見圖2。

Figure 2.The protein expression of PDGFA and PDGFRα in the oocytes of each group.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs blank group；##P＜0.01 vs blank serumgroup.圖2 各組卵母細胞中PDGFA和PDGFRα蛋白的表達

4 養精種玉湯對PDGFA和PDGFRαmRNA表達的影響

real-time PCR結果顯示，與空白組和空白血清組比較，養精種玉湯血清組PDGFA和PDGFRα的mRNA表達量減少（P＜0.01），見圖3。

Figure 3.The mRNA expression of PDGFA and PDGFRα in the oocytes of each group.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs blank group；##P＜0.01 vs blank serumgroup.圖3 PDGFA和PDGFRα的mRNA在各組卵母細胞中表達的變化

討 論

養精種玉湯出自《傅青主女科》，由熟地、當歸、白芍和山萸肉組成。功效平補肝腎，填精益血，本方所治之證因精血不足，肝腎陰虛，沖任失養而成，故立補血養精之法，精血充足，沖任得養而種子成孕［13］。中醫認為：“腎藏精，腎為天癸之源，沖任之本，腎氣盛，沖任滿盈，天癸蓄極泌至，月事以時下，經調而有子。”名醫羅元愷曾指出天癸是非肉眼所能見的元陰，溶于血中，與西醫的雌激素尤其相似。在血分雌激素的影響下，卵泡不斷發育，當雌激素亦即“陰”的水平達到重陰時卵泡發育成熟，排出卵子，故“女精”即卵子。卵子之精在血分“陰”提高的前題下溢瀉，所以有“精血”同源和“精、陰、血”同源之說。傅山所創養精種玉湯，說明血中補陰，陰中養精，養精才能種玉的道理，同時又把血、陰、精聯系在一起，從中醫的腎-天癸-沖任這一生殖軸確立治療原則［14-15］。后歷經無數醫家的反復臨床實踐及療效驗證，現已成為治療不孕癥的基礎方［16］。

PDGF是機體內一種重要的促分裂劑和趨化劑，能刺激機體內各種類型的細胞分裂和增殖［17］。Nilsson等［18］提出PDGF由卵母細胞產生，其作用于周圍的顆粒和卵泡膜/間質細胞以促進原始卵泡發育。一些研究報道了哺乳動物卵巢中PDGF及其受體存在于大鼠［11］、人類［19］和豬［10］等，這些實驗研究以卵泡或卵巢為研究對象，利用免疫組化研究PDGF蛋白對卵泡發育的作用。但有研究者指出雖然卵泡中卵母細胞的免疫反應性似乎非常特異，但尚不清楚在發育的后期階段卵泡中觀察到的卵母細胞染色是由于蛋白質的存在，還是非特異性抗體結合導致的［11］。本實驗結果顯示，養精種玉湯血清組較空白組卵母細胞成熟率明顯提高，且PDGFA和PDGFRα表達較空白組減少，表明養精種玉湯可以提高小鼠卵母細胞的體外成熟率，同時也證實了在卵泡發育的后期階段中觀察到的卵母細胞PDGFA和PDGFRα染色是由于其蛋白質的存在。

PDGF作為重要的促有絲分裂原，通過與靶細胞膜上的α和β蛋白酪氨酸激酶受體結合，促使有絲分裂信號向胞內傳遞，從而引起DNA合成、細胞分裂及增殖［17，20］。PDGF結合使PDGFRα二聚化，并激活受體的激酶活性，觸發細胞內信號傳導級聯反應，包括Ras-MAPK、PI3K和PLCγ途徑，這些途徑都參與了卵母細胞的成熟過程。例如：PDGFR主要通過銜接蛋白Grb2和Shc連接到Ras-MAPK，Grb2通過其SH2結構域結合激活的PDGFR，并通過其SH3結構域復合Sos1激活Raf-1和MAPK級聯的下游，從而刺激細胞生長［21］。此外，PDGF在培養細胞中的表達是動態的［21］。Pascuali等［22］研究發現，青春期前（卵泡正處于發育階段）大鼠PDGF受體的抑制導致卵泡膜和顆粒細胞增殖減少，雌激素濃度降低，他們認為局部抑制PDGF會增加卵巢細胞凋亡，從而發生大量卵泡閉鎖。有研究表明，PDGF家族成員的表達受激素調節，用雌激素治療未成熟小鼠24 h可降低卵巢PDGF及其受體的表達，且免疫組化結果顯示PDGFRs的免疫染色隨著卵泡發育至竇前期（卵母細胞成熟之前）而增強，但此后減弱［23］。上述研究表明，PDGF及其受體的蛋白表達在發育的卵母細胞中升高，而在卵母細胞成熟時表達下降。本實驗結果顯示養精種玉湯血清組PDGFA和PDGFRα水平較空白組下降，說明養精種玉湯可能通過下調PDGFA和PDGFRα的蛋白和mRNA表達來促進小鼠卵母細胞的體外成熟。

本實驗將養精種玉湯與輔助生殖相結合，豐富了“腎主生殖”的內涵，有利于中醫藥在輔助生殖中的應用與發展，為輔助生殖領域開辟新途徑。