可溶性Klotho蛋白抑制THP-1源性泡沫細胞形成*

劉 瑋， 李 琳， 劉佳妮， 石 晶， 洪 畋， 陳秀娟

（武漢市中心醫院老年科，湖北武漢430014）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心血管疾病的重要病理基礎，預防AS的形成是防治心血管病的根本措施。AS的基因治療是目前研究的熱點，但仍還處于起步階段。調控AS發生發展的基因數量眾多，機制復雜，因此尋找更多更有效的基因治療靶點尤為重要。Klotho（KL）基因是Kuro-o等［1］在1997年發現的與衰老相關的新基因，KL基因敲除小鼠可呈現出類似人類衰老的各種表型，如壽命縮短、動脈硬化、不育癥、骨質疏松、皮膚萎縮、肺氣腫等［1］。大量研究表明，KL蛋白具有一定的抑制AS的作用［2-5］，但其具體機制尚不明確。

膽固醇的代謝異常將導致單核-巨噬細胞內膽固醇的蓄積，從而形成泡沫細胞，而泡沫細胞的形成是AS形成早期的標志性事件。KL蛋白可否調控泡沫細胞形成以及相關的分子機制目前國內外尚無相關報道。酰基輔酶A：膽固醇酰基轉移酶1（acyl-coenzyme A：cholesterol acyltransferase 1，ACAT1）是細胞內唯一催化長鏈脂肪酸和游離膽固醇（free cholesterol，FC）酯化形成膽固醇酯（cholesterol ester，CE）的關鍵酶。而由ACAT1合成的CE在細胞內大量蓄集是動脈粥樣硬化灶中泡沫細胞形成的主要特征。ATP結合盒轉運體家族（ATP-binding cassette transporters，ABCs）中的ABCA1是調控細胞內膽固醇流出的關鍵因子［6］。本研究通過觀察可溶性KL蛋白對THP-1源性巨噬細胞內膽固醇流出、THP-1源性泡沫細胞形成及ACAT1和ABCA1表達的影響，探討可溶性KL蛋白是否通過調控ACAT1和ABCA1的表達，從而影響巨噬細胞內CE蓄積和膽固醇流出，抑制泡沫細胞形成，從而發揮抗AS的作用。

材料和方法

1 材料

THP-1單核細胞株購自ATCC。細胞膽固醇檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；油紅O和［3H］-膽固醇（Sigma）；TRIzol（Ambion）；SYBR Green PCR試劑盒（KAPA Biosystems）；逆轉錄試劑盒（TaKaRa）；ACAT1及 ABCA1抗體（Abcam）；GAPDH抗體（CST）；氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗兔Ⅱ抗（Bioswamp）；佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）購自Gene Operation。

2 方法

2.1 細胞培養及分組 THP-1細胞株按ATCC的說明進行培養和傳代，加入含160 nmol/L PMA的低血清培養液，37℃、5%CO2培養48 h，觀察細胞貼壁狀態，確定THP-1單核細胞已誘導分化為巨噬細胞。換用含80 mg/L ox-LDL的低血清培養基繼續培養48 h，觀察泡沫細胞形成。細胞分為陰性對照組（THP-1巨噬細胞組）、陽性對照組（THP-1泡沫細胞組）和不同濃度KL蛋白組（THP-1源性巨噬細胞經25、50、100和200 μg/L［7］的重組KL蛋白預處理后2 h后，再按照THP-1泡沫細胞組程序操作）。

2.2 油紅O染色 各組細胞均加入4%多聚甲醛固定10～15 min，加入油紅O染液染色10 min，再用蘇木素染液復染2～3 min，然后雙蒸水沖洗并封片，在顯微鏡鏡下觀察，可觀察到細胞內脂滴呈紅色，而細胞核呈藍色。

2.3 膽固醇流出率測定［8］THP-1細胞與［3H］標記的膽固醇共同孵育24 h后裂解細胞，用液體閃爍計數儀檢測培養液和細胞裂解物中［3H］標記的膽固醇水平，膽固醇流出率（%）=培養液放射強度/（培養液放射強度+細胞裂解物放射強度）×100%（放射強度的單位為cpm，即min-1）。

2.4 細胞內總膽固醇（total cholesterol，TC）、FC及CE含量的測定 離心法收集各組細胞后，用PBS漂洗3次，用超聲破碎細胞后，按細胞膽固醇檢測試劑盒的說明操作，用酶熒光學法分別測定細胞內FC和TC的含量。CE為TC與FC的差值。CE占TC達到50%以上的細胞可認為已轉變為泡沫細胞。

2.5 Western blot法檢測ACAT1和ABCA1蛋白的表達 離心法收集各組細胞，加入細胞裂解液提取總蛋白，并用BCA法測定蛋白質的濃度，用9%SDSPAGE進行電泳分離，每孔上樣量為20μg，然后進行轉膜，封閉，加Ⅰ抗及HRP標記的Ⅱ抗，用ECL顯影液進行熒光顯色，然后將膜放置于全自動化學發光分析儀中進行檢測。實驗結果采用TANON GIS軟件讀取條帶灰度值；將各組的ACAT1和ABCA1分別與相應GAPDH的面積灰度值進行比較，二者的比值代表ACAT1和ABCA1蛋白的表達。

2.6 RT-qPCR法檢測ACAT1和ABCA1 mRNA的表達 收集各組細胞，按TRIzol試劑盒的說明提取總RNA，消除所提取的總RNA中的DNA及并除去DN-ase1后，取500 ng總RNA反轉錄合成cDNA，再取2.5μL反轉錄產物進行PCR循環。采用Real-Time System熒光定量PCR儀（BIO-RAD）進行反應。ACAT1的上游引物序列為5′-GCTGCTCTGGTTCTCAT-3′，下游引物序列為5′-GGCTTCATTTACTTCCC-3′，擴增片段大小195 bp；ABCA1的上游引物序列為5′-GAGGTTGCTGCTGTGGA-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-GGCATGGCTTTATTTGG-3′，擴增片段大小165 bp；βactin的上游引物序列為5′-TGCCCATCTACG-3′，下游引物序列為5′-TGTCACGCACGATTTCC-3′，擴增片段大小153 bp。反應程序：95℃3 min；95℃5 s，56℃ 10 s，72℃ 25 s，39 cycles；65℃ 5 s；95℃ 50 s。數據采用儀器自帶的qbase+軟件分析。β-actin為內參照，運用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。ΔCt=Ct目的基因-Ct內參照；ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。

3 統計學處理

數據用均數±標準差（mean±SD）表示，采用SPSS16.0統計軟件進行單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，相關的濃度劑量效應關系采用線性相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 油紅O染色觀察可溶性KL蛋白對THP-1源性泡沫細胞形成的影響

油紅O染色鏡下觀察，陰性對照組的細胞質內未見明顯的紅色脂滴，而在陽性對照組的細胞質內可觀察到大量的紅色脂滴，符合泡沫細胞的形態特點。與陽性對照組相比，不同濃度KL蛋白組中，隨著可溶性KL蛋白濃度的增高，細胞質內紅色脂滴數量呈現逐漸減少的趨勢，見圖1。

Figure 1.Lipid droplets in THP-1 cells detected by oil red Ostaining.A：negative control group（THP-1-derived macrophages）；B：positive control group（THP-1-derived foam cells in the presence of ox-LDL）；C～F：THP-1-derived macrophages were pretreated with soluble Klotho protein（25，50，100 and 200 μg/L）for 2 h，and then treated with ox-LDL for 48 h.The scale bar=20μm.圖1 油紅O染色觀察各組細胞胞漿內脂滴的變化

2 可溶性KL蛋白對膽固醇酯合成的影響

酶熒光學法檢測顯示，陰性對照組細胞內CE/TC比值＜50%；而陽性對照組的CE/TC比值＞50%，符合泡沫細胞的生化特點；與陽性對照組相比，不同濃度KL蛋白組細胞內TC和CE的含量隨著可溶性KL蛋白濃度的增高逐漸降低（相關系數r分別為-0.95和-0.96，均P＜0.05），當KL蛋白濃度為50、100和200μg/L時，CE/TC比值均小于50%，并且呈逐漸遞減的趨勢，見表1。

3 可溶性KL蛋白對膽固醇流出的影響

液體閃爍計數法顯示，陽性對照組細胞膽固醇流出率與陰性對照組相比明顯降低（P＜0.05）；與陽性對照組相比，不同濃度KL蛋白組隨著可溶性KL蛋白濃度的增高，膽固醇流出率逐漸升高，當KL蛋白濃度為50、100和200μg/L時，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

4 可溶性KL蛋白對ACAT1和ABCA1蛋白表達的影響

陽性對照組的ACAT1蛋白表達與陰性對照組相比明顯上調（P＜0.05）；不同濃度KL蛋白組與陽性對照組相比，隨著KL蛋白濃度的增高，細胞內ACAT1蛋白表達逐漸降低（r=-0.92，P＜0.05），見圖2。

與陰性對照組相比，陽性對照組ABCA1的蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；不同濃度KL蛋白組與陽性對照組相比，隨著KL蛋白濃度的增高（從25μg/L到100μg/L），細胞內ABCA1蛋白表達逐漸增多（P＜0.05），而200μg/L KL組與100μg/L KL組相比，ABCA1蛋白表達的差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

表1 可溶性KL蛋白對各組細胞TC、FC和CE含量的影響Table 1.Effects of soluble Klotho（KL）protein on total cholesterol（TC），free cholesterol（FC）and cholesteryl ester（CE）in THP-1-derived macrophages（Mean±SD.n=3）

表2 可溶性KL蛋白對各組細胞膽固醇流出率的影響Table 2.Effects of soluble Klotho（KL）protein on cholesterol efflux of THP-1-derived macrophages（Mean±SD.n=3）

5 可溶性KL蛋白對ACAT1和ABCA1 mRNA表達的影響

陽性對照組ACAT1 mRNA的表達與陰性對照組相比顯著上調（P＜0.05）；不同濃度KL蛋白組與陽性對照組相比，隨著KL蛋白濃度的增高，細胞內ACAT1 mRNA的表達逐漸降低（r=-0.94，P＜0.05），見圖3A。與陰性對照組相比，陽性對照組ABCA1 mRNA的表達顯著降低（P＜0.05）；不同濃度KL蛋白組與陽性對照組相比，隨著KL蛋白濃度的增高，細胞內ABCA1 mRNA的表達逐漸增多（r=0.88，P＜0.05），見圖3B。

討 論

膽固醇酯在巨噬細胞內大量蓄集并形成泡沫細胞是AS早期病變的典型病理特征。在AS的形成過程中，膽固醇代謝異常是一個重要環節，ACAT1和ABCA1在此環節中扮演了角色，ACAT1主要負責膽固醇酯的合成，而ABCA1主要負責膽固醇的流出。ACAT1是細胞內膽固醇酯合成的關鍵酶，調節著游離膽固醇和膽固醇酯之間的平衡。研究顯示，在THP-1源性巨噬細胞中過表達ACAT1將促進泡沫細胞形成［9］，而ACAT1反義寡核苷酸及ACAT1抑制劑可抑制泡沫細胞形成［10］。ABCA1可介導細胞內磷脂和游離膽固醇轉運至載脂蛋A1，從而促進高密度脂蛋白生成，啟動膽固醇逆向轉運過程，在機體清除多余脂質的過程中發揮重要作用［11-12］。

人類的KL基因可以通過不同的拼接方式選擇性拼接而產生兩種蛋白產物：分泌型KL蛋白和膜型KL蛋白。分泌型KL可以作為一種內分泌激素或內循環因子，通過細胞內信號轉導通路調節相應的靶基因表達，從而發揮其生物學作用［13-14］。KL基因缺陷小鼠在4周齡大小就開始出現動脈粥樣硬化的征象，并能隨著增齡而逐漸加重。而將外源性KL基因轉導入KL基因缺陷的小鼠體內后，其動脈粥樣硬化程度可得到顯著改善［15］。并且，體外轉染外源性KL基因能減輕大鼠心肌細胞的缺血再灌注損傷［16］。Junsuke等［17］觀察到KL可通過調節體內的氧化應激從而改善內皮細胞功能障礙。我們前期的研究也表明，老年冠心病患者的血漿KL蛋白水平與冠脈狹窄程度呈負相關［18］。上述研究表明，KL蛋白具有抑制動脈粥樣硬化進程的作用。然而，KL蛋白抑制動脈粥樣硬化的相關機制尚不明確，對泡沫細胞形成的影響及相關機制尚無相關報道。本研究分別從泡沫細胞的形成、細胞內膽固醇的流出、ABCA1及ACAT1蛋白質表達和mRNA表達水平探討了可溶性KL蛋白對THP-1單核細胞源性泡沫細胞形成中ABCA1和ACAT1表達的影響。實驗結果表明，在ox-LDL的刺激下，發生THP-1巨噬細胞的泡沫化（陽性對照組），ACAT1蛋白及mRNA表達均顯著增加，而ABCA1蛋白及mRNA表達均顯著降低。加入外源性的可溶性KL蛋白后，隨著可溶性KL蛋白濃度的升高，THP-1巨噬細胞泡沫化的程度逐漸減輕，膽固醇的流出逐漸增加。且可溶性KL蛋白能夠呈濃度依賴性的抑制ox-LDL誘導的泡沫細胞形成過程中，ACAT1蛋白及mRNA表達的上調以及ABCA1蛋白及mRNA表達的下調，說明可溶性KL蛋白作為一種內循環因子，可能通過調控巨噬細胞內ACAT1及ABCA1的表達，進而減少細胞內膽固醇的蓄積，抑制THP-1源性泡沫細胞形成。

Figure 2.The protein expression of ACAT1 and ABCA1 in each group detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs negative control group；#P＜0.05 vs positive control group.圖2 Western blot檢測各組ACAT1和ABCA1的蛋白表達

Figure 3.The mRNA expression of ACAT1（A）and ABCA1（B）in each group detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs negative control group；#P＜0.05 vs positive control group.圖3 RT-qPCR檢測各組ACAT1和ABCA1的mRNA表達

綜上所述，ACAT1和ABCA1是調節細胞內膽固醇代謝的2個關鍵蛋白，分別調控膽固醇的合成和流出，可溶性KL蛋白通過抑制ACAT1表達，促進ABCA1表達，抑制細胞內膽固醇酯的蓄積，增加膽固醇的流出，進而阻礙泡沫細胞的形成，抑制AS的發生、發展。我們初步探討了在體外細胞實驗中，能否通過加入外源性分泌型KL基因的方法，從轉錄水平調控ABCA1和ACAT1的表達，從而抑制泡沫細胞形成。