基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的細(xì)菌性腦炎大鼠腦脊液代謝組學(xué)研究

劉悅，高林

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)重癥科，河南 鄭州 450052)

細(xì)菌性腦炎是嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，如果未及時(shí)有效地治療，可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)局甚至死亡。由于非特異性體征和癥狀，很多病例在快速、準(zhǔn)確的診斷方面面臨重大挑戰(zhàn)[1]。據(jù)估計(jì)，高達(dá)50%的腦炎病例和60%的腦膜炎病例病因不明[2]。由于最終診斷的缺乏，許多患者缺乏以證據(jù)為基礎(chǔ)的治療。腦脊液的常規(guī)生化和細(xì)胞學(xué)分析可能有助于快速區(qū)分不同類型的感染，但難以識別特定的病因。微生物學(xué)培養(yǎng)具有很高的特異性，但耗時(shí)久，如已使用抗菌藥物或感染是由苛求性或不可培養(yǎng)的微生物引起，則結(jié)果可能為陰性。尋找適合早期診斷的生物標(biāo)志物是相關(guān)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。近年來，代謝組學(xué)的發(fā)展為研究疾病的發(fā)病機(jī)制及尋找新的診斷生物標(biāo)志物提供了更有效的技術(shù)手段，其關(guān)注的對象是相對分子質(zhì)量1 000以下的化合物，通過分析疾病狀態(tài)下的代謝物譜，對由疾病引起的代謝產(chǎn)物的改變進(jìn)行代謝組學(xué)分析，能幫助人們更好地理解病變過程和機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑，發(fā)現(xiàn)疾病的生物標(biāo)記物，并輔助臨床診斷[3]。本研究利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析大鼠顱內(nèi)金黃色葡萄球菌感染時(shí)腦脊液中的代謝產(chǎn)物，以便更好地展現(xiàn)病變狀態(tài)的代謝特征，并尋找可能的生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑Ultimate 3000超高效液相色譜儀(Dionex)串聯(lián)Q-Exactive型高分辨質(zhì)譜(Thermo FisherScientific)，真空離心濃縮儀(Eppendorf)，高速離心機(jī)，立體定位儀等。高效液相色譜級甲醇、水、乙腈和異丙醇(Sigma-Aldrich)，甲酸(Dikma Technologies)，氯仿(Amresco)等。金黃色葡萄球菌(CGMCC 1.8721)購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 菌群培養(yǎng)將金黃色葡萄球菌凍干粉溶解于腦心浸液，在37 ℃下孵育過夜，然后在肉湯培養(yǎng)液中以160 r·min-1的速度持續(xù)振蕩直至OD630為0.6。然后將培養(yǎng)物以3 000 g離心10 min，用無菌生理鹽水稀釋至所需濃度(1×106CFU)。

1.3 大鼠細(xì)菌性腦炎模型的建立本實(shí)驗(yàn)通過鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批(倫理審查編號2019-KY-42)。將24只6～8周齡的雄性SD大鼠[購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號 SCXK(豫)2017-0001]隨機(jī)分為正常對照組和感染組，每組各12只。造模方法同文獻(xiàn)[4]，于大鼠腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛(300 mg·kg-1)麻醉后，將大鼠頭部固定于立體定位儀，中空耳棒置于耳前顴骨上，頭部保持水平。以前囟為零點(diǎn)值，于前囟后1.0 mm、中線右側(cè)1.0 mm處，用電鉆鉆開顱骨，粗針挑開硬腦膜，微量注射器垂直進(jìn)針2.5～3.0 mm，緩慢注入5 μL前面制備的金黃色葡萄球菌混懸液，注射后留針5～10 min。注射完畢后拔針，縫合皮膚，將大鼠放回鼠籠讓其自然蘇醒。對照組以生理鹽水替代金黃色葡萄球菌混懸液，余操作與感染組相同。

1.4 組織病理學(xué)檢查造模48 h后將大鼠腹腔麻醉，然后以體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛及生理鹽水灌注。暴露鼠腦并輕輕取出，以體積分?jǐn)?shù)4%的蔗糖甲醛固定48 h后，對冷凍切片行蘇木精-伊紅(HE)染色，并于光鏡下觀察病理標(biāo)本組織學(xué)改變。

1.5 腦脊液的采集麻醉方法如上，將大鼠頭部固定于立體定位儀，使頭與身體成約135°角，用1 mL無菌注射器在小腦延髓池處水平進(jìn)針，采集腦脊液約130 μL，置于離心管。每個(gè)樣本在2 000 g、4 ℃下離心10 min，以去除細(xì)胞和/或組織碎片，然后在-80 ℃保存待用。

1.6 樣本預(yù)處理用預(yù)冷的甲醇提取腦脊液代謝物。120 μL樣本在4 ℃、14 000 r·min-1下離心20 min。轉(zhuǎn)移上清液至新的預(yù)冷過的離心管并與520 μL預(yù)冷的甲醇混合成體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶液。每個(gè)樣品在-80 ℃孵育2 h，輕輕搖勻。離心后轉(zhuǎn)移500 μL上清液至新的離心管并在真空濃縮儀中常溫干燥，然后在-80 °C保存待用。

1.7 LC-MS分析高效液相色譜條件：在正離子模式下，使用Atlantis HILIC硅膠柱(2.1×100 mm Waters)。流動(dòng)相A：溶解0.63 g甲酸銨于50 mL水，然后加入950 mL乙腈和1 μL甲酸。流動(dòng)相B：溶解0.63 g甲酸銨于500 mL質(zhì)譜級水，然后加500 mL乙腈和1 μL甲酸。梯度洗脫時(shí)將流動(dòng)相A或B以水配成不同的體積分?jǐn)?shù)，具體條件如下：起始時(shí)間，1% B；2 min，1% B；3.5 min，20% B；17 min，80% B；17.5 min，99% B；19 min，99% B；19.1 min，1% B；22 min，1% B。在負(fù)離子模式下，使用ACQUITY UPLC BEH酰胺柱(2.1×100 mm Waters)。流動(dòng)相A：將0.77 g乙酸銨溶于50 mL水中，再加入950 mL乙腈。用氫氧化銨溶液將pH調(diào)至9.0。流動(dòng)相B：將0.77 g乙酸銨溶于500 mL HPLC級的水中，加入500 mL HPLC級的乙腈，用氫氧化銨溶液調(diào)節(jié)pH至9.0。梯度洗脫條件如下：起始時(shí)間，5% B；2 min，5% B；4 min，20% B；18 min，85% B；19 min，95% B；21 min，95% B；21.1 min，5% B；25 min，5% B。

1.8 數(shù)據(jù)分析使用Q Exactive Orbitrap質(zhì)譜儀(Thermo，CA)進(jìn)行代謝物分析，原始數(shù)據(jù)通過Tracefinder(Thermo，CA)進(jìn)行代謝物鑒定和驗(yàn)證等。使用Metaboanalyst 3.0 (www.metaboanalyst.ca)進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化、t檢驗(yàn)、主成分分析(principalcomponent analysis，PCA)、偏最小二乘判別分析(partial least squaresprojection to latent structures-discriminant analysis，PLS-DA)、代謝路徑分析等。

2 結(jié)果

2.1 大鼠金黃色葡萄球菌腦炎模型感染組鼠腦HE染色可見腦膜和腦實(shí)質(zhì)中出現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤、局灶性出血及組織壞死。見圖1。

圖1 感染性腦炎模型大鼠腦組織HE染色病理學(xué)表現(xiàn)(×10；×20)

2.2 數(shù)據(jù)分析采用非靶向LC-MS/MS分析感染組和對照組大鼠的腦脊液，共檢測出447種代謝產(chǎn)物。將其導(dǎo)入SIMCA-P中進(jìn)行多變量分析。圖2所示的PCA模型顯示了術(shù)后兩組代謝產(chǎn)物的差異。為更好地對兩組樣本代謝圖譜進(jìn)行分型并篩選差異代謝物，用PLS-DA可視化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)間的差異，兩組圖像在PLS-DA評分圖中完全分開，表明它們具有明顯不同的代謝特征，見圖3。

2.3 差異代謝物篩選經(jīng)過分析和驗(yàn)證(VIP>1，P<0.05)，從已發(fā)現(xiàn)的447種代謝物中篩選出16種差異代謝物，其中膽堿、乳酸鹽、檸檬酸鹽、芥酸酰胺、L-蘇氨酸、犬尿氨酸、硫酸苯酯、甜菜堿、乙酰乙酸、丙三醇、2-羥基丁酸、谷氨酰胺、L-丙氨酸水平上調(diào)，左旋肉堿、十八烯酸、棕櫚酸水平下降。

2.4 代謝通路分析將分析篩選出來的差異代謝物，使用MetaboAnalyst在線分析網(wǎng)站構(gòu)建與細(xì)菌性腦炎相關(guān)的代謝途徑圖譜，觀察差異代謝途經(jīng)變化。結(jié)果提示，16個(gè)關(guān)鍵代謝物參與了24個(gè)代謝途徑。見表1。

t1為第1主成分，t2為第2主成分。

圖2 細(xì)菌性腦炎模型大鼠與正常大鼠PCA得分圖

t1為第1主成分，t2為第2主成分。

圖3 細(xì)菌性腦炎大鼠與正常大鼠PLS-DA得分圖

表1 主要差異代謝物及其相關(guān)通路

3 討論

在過去的10 a中，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的進(jìn)步徹底改變了非靶向代謝組學(xué)分析方法，其強(qiáng)大的分離能力和高靈敏度的檢測能力為代謝組學(xué)分析提供了強(qiáng)有力的技術(shù)保障。通過更深入地挖掘代謝組，研究人員能夠發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的代謝產(chǎn)物及其與疾病的關(guān)系。非靶向代謝組學(xué)的應(yīng)用促進(jìn)了新的生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)了對疾病機(jī)制的理解[5]。

細(xì)菌性腦炎是一種臨床常見疾病，但由于癥狀不典型、病史描述不清等易造成病程判斷不準(zhǔn)確，或因患者就診前已接受過抗生素治療等而增加了相關(guān)臨床研究的困難。本實(shí)驗(yàn)首次采用嚙齒類動(dòng)物制造金黃色葡萄球菌顱內(nèi)感染模型，分析金黃色葡萄球菌顱腦感染大鼠模型與正常大鼠腦脊液代謝產(chǎn)物水平的差異，實(shí)驗(yàn)條件可控，樣本間可比性提高。本實(shí)驗(yàn)中，兩組大鼠代謝途徑存在明顯差異。結(jié)果表明，腦脊液代謝組學(xué)具有區(qū)分細(xì)菌性腦炎大鼠與正常大鼠的能力。本研究共篩選出16種差異性代謝物，包括膽堿、乳酸鹽、檸檬酸鹽、芥酸酰胺、L-蘇氨酸、犬尿氨酸、硫酸苯酯、甜菜堿、乙酰乙酸、丙三醇、左旋肉堿、2-羥基丁酸、棕櫚酸、谷氨酰胺、十八烯酸、L-丙氨酸，其中一些分子在以前的相關(guān)研究報(bào)道中很少提及。

膽堿是磷脂酰膽堿和神經(jīng)鞘磷脂的關(guān)鍵組成成分，通過其代謝物甜菜堿參與S-腺苷甲硫氨酸的合成，S-腺苷甲硫氨酸是組蛋白和DNA甲基化的主要甲基供體。膽堿的功能還包括維持膜的結(jié)構(gòu)完整性和調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)傳遞[6]。據(jù)報(bào)道，在腦膜炎病例中，含有膽堿的化合物顯著增多，這可能是由于炎癥過程中細(xì)胞因子增加了對磷脂酶A2活性的刺激作用。除此之外，膳食甜菜堿可通過氧化應(yīng)激抑制NF-κB的激活，抑制促炎分子的表達(dá)，如環(huán)氧合酶-2和一些腫瘤壞死因子[7]。色氨酸-犬尿氨酸通路是內(nèi)源性色氨酸分解代謝的主要途徑，它的功能除了維持內(nèi)源性色氨酸穩(wěn)態(tài)，還涉及免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)調(diào)節(jié)及細(xì)胞保護(hù)等。炎癥會激活犬尿氨酸途徑，導(dǎo)致色氨酸耗竭并形成具有潛在神經(jīng)毒性的物質(zhì)(如喹啉酸、3-羥基犬尿氨酸)和神經(jīng)保護(hù)性的物質(zhì)(如犬尿烯酸)[8]。既往研究發(fā)現(xiàn)，犬尿氨酸水平在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染細(xì)菌或病毒時(shí)會顯著升高，可作為臨床重要的生物標(biāo)志物，與腦脊液中其他神經(jīng)炎癥指標(biāo)結(jié)合使用時(shí)效果更好[9]。既往研究顯示，腦脊液乳酸水平對于細(xì)菌性腦炎可能是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)測參數(shù)[10]。從病理生理學(xué)角度看，腦脊液乳酸水平的升高可能存在混雜因素，如癲癇、腦組織壞死、腦血流減少、葡萄糖供應(yīng)減少等，也可能是因?yàn)榉侨毖缘哪X糖酵解激活以維持能量需求的增加，其含義需謹(jǐn)慎解釋。腦膜炎病例的腦脊液樣本中各類游離氨基酸水平的升高可能是由于腦炎病理生理過程中蛋白水解酶活性的增加和血腦屏障的破壞[11]。酮體(2-羥丁酸和丙酮)是肝臟脂肪組織中脂肪酸氧化的副產(chǎn)物[12]。據(jù)報(bào)道細(xì)菌感染期間血清中酮體水平升高，腦膜炎也可導(dǎo)致腦脊液中酮體水平改變。在腦膜炎病例中觀察到的檸檬酸鹽水平升高可能與檸檬酸鹽通過調(diào)節(jié)炎癥基因反式激活來調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)。

通過LC-MS/MS技術(shù)可區(qū)分細(xì)菌性腦炎與正常大鼠，具有較高的可靠性。本研究發(fā)現(xiàn)16種關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，其可能是鑒別診斷細(xì)菌性腦炎的潛在生物標(biāo)志物，為進(jìn)一步了解其病理生理過程提供了有價(jià)值的信息。本實(shí)驗(yàn)對象為大鼠且樣本數(shù)量有限，需要更大樣本的研究及相關(guān)臨床研究以進(jìn)一步評估該方法的診斷價(jià)值及潛在應(yīng)用范圍。