羅非魚循環水養殖系統中一株肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定及其脫氮性能研究

王秀華，武和英，楊 冰，張 琴，于黨輝，黃 倢

(1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，青島海洋科學與技術國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，農業農村部海水養殖病害防治重點實驗室，青島市海水養殖流行病學與生物安保重點實驗室，山東青島 266071；2.廣西壯族自治區海洋研究所，廣西海洋生物技術重點實驗室，廣西北海 536000)

隨著水產養殖用地的逐年減少和養殖用水資源的日益短缺，集約化高密度的養殖模式已成為水產養殖業發展的趨勢。而在高密度水產養殖系統中，因殘餌、糞便分解導致的高濃度氨氮及亞硝基氮等有害物質給養殖動物帶來了潛在的危害，如影響養殖動物正常的生理代謝[1]，破壞機體免疫力，加速病害發生[2]。因此研究降解養殖水體中氨氮、亞硝基氮的技術方法，將有助于促進當前水產養殖業的健康發展。

本研究從山東德州市一羅非魚養殖場循環水養殖系統的脫氮池中分離到一株具有高效脫氮特性的細菌，研究了不同培養條件對其脫氮效果的影響，采用Biolog細菌鑒定系統及16S rDNA序列比對方法對該菌進行了初步的分類鑒定，同時對該菌進行了生物安全性評價，以期為該菌的開發利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品來源

菌株安全性評價用斑馬魚(daniorerio)300尾，購買于市場，平均體長(2.0±0.1)cm、平均體重(0.25±0.01)g。攻毒感染前，實驗室暫養2周。

1.1.2 脫氮培養基

氨氮培養基與亞硝酸鹽培養基配制方法參照文獻[6]，氨氮培養基(g/L)：丁二酸鈉 1.69；NH4Cl 0.08；MgSO4·7H2O 0.2；KH2PO40.05；Na2HPO40.5；NaCl 5.0；pH 6～7。亞硝酸鹽培養基(g/L)：丁二酸鈉 1.69；NaNO20.1；MgSO4·7H2O 0.2；KH2PO40.05；Na2HPO40.5；NaCl 5.0；pH 6～7。配制氨氮培養基、亞硝酸鹽培養基，分別先配制不含有NH4Cl、NaNO2的基礎成分。基礎成分配制完畢后，各培養基均經121 ℃高壓滅菌20 min，之后將經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌的一定濃度的NH4Cl、NaNO2母液，按相應的比例加入到滅菌后的培養基中。在液體培養基的基礎上加入2%的瓊脂則為固體培養基。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的采集和分離純化

從山東省德州市一羅非魚養殖場循環水養殖系統的脫氮池和山東省濰坊市一內陸對蝦養殖場的半咸水對蝦養殖池中分別采集水樣，置入無菌采樣瓶，低溫條件下帶回實驗室，用LB平板劃線分離純化(LB培養基：蛋白胨 1%；酵母提取物 0.5%；NaCl 1%)，對不同的菌株編號入菌種資源庫保存備用。

1.2.2 脫氮菌株的篩選

1.2.3 脫氮菌株碳源的篩選

1.2.4 菌株在不同鹽度中的脫氮效果

1.2.5 菌株在不同pH中的脫氮效果

1.2.6 菌株在不同C ∶N比中的脫氮效果

1.2.7 菌株在硝化和亞硝化培養基中的生長曲線及對應的脫氮效果

1.2.9 菌株安全性實驗評價

用LB液體培養基將待測菌株28 ℃活化24 h后，4 ℃ 4 000g離心15 min，沉淀用PBS稀釋成菌懸液，并用曝氣48 h后的自來水將菌懸液分別稀釋成2×104、2×105、2×106、2×107、2×108CFU/mL五個濃度梯度的菌液，用于浸泡感染實驗，空白組加入10%的PBS。實驗用水族箱每個有效水體5 L，每組放入斑馬魚40尾，每組設置兩個平行。

感染用斑馬魚實驗前停喂餌料24 h，置入菌液后24 h恢復正常投喂管理，每天進行吸污和換水，日換水量為30%。每天早晚2次觀察并記錄每組斑馬魚的死亡情況，直到一周之內不再死亡即停止觀察，然后統計累計死亡率。

1.2.10 菌株鑒定

16S rDNA序列分析比對及系統發育分析法：細菌DNA提取采用細菌基因組 DNA 快速抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)，細菌16S rDNA序列擴增方法參照文獻[8]。擴增產物委托上海生工生物工程技術有限公司進行分析，所得序列在NCBI數據庫中利用BLAST進行同源性比對，選取同源性較高的序列，利用MEGA 5.0 進行多重比較后通過鄰接法構建系統發育樹，以確定分離菌株的分類地位。

Biolog細菌鑒定：采用Biolog微生物自動分析系統(MICROSTATION，Biolog，美國)，細菌純培養采用Biolog BUG 的固體培養基，28 ℃恒溫培養12 h，再將菌落用液體培養基(IF-B)稀釋(Biolog，美國)，稀釋的菌液加入到Gen III 微板中(每個孔100 μL)，28 ℃恒溫培養24 h，然后用MICROSTATION進行鑒定。

1.2.11 數據分析

試驗數據用平均數±標準方差(x±s，n=3)的方法來表示，運用軟件SPSS18.0，經One-Way ANOVA 分析，采用Duncan’s多重檢驗分析試驗結果平均數的差異顯著性，設差異水平α=0.05 (P<0.05為差異顯著)。

2 結果與分析

2.1 脫氮菌株的篩選

從羅非魚養殖系統和對蝦養殖池中共分離出13株菌株，其中有6個菌株既能在硝化培養基中生長也能在亞硝酸鹽培養基中生長，結果見表1。選取去氨氮效果最佳的菌株DZYC2016100902(簡稱DZYC02菌株)為本實驗的目的菌株用于后續研究，該菌株在硝化培養基及亞硝酸鹽培養基中菌落呈白色、圓形、邊緣整齊，菌落1 mm左右，在LB培養基中為乳白色，圓形、邊緣整齊，菌落2 mm左右，表面濕潤有光澤。

表1 不同菌株對氨氮的去除率Tab.1 Removal rates of ammonia nitrogen by different bacterial strains %

2.2 碳源對菌株DZYC02脫氮效果的影響

菌株DZYC02在不同碳源條件下對氨氮的去除率如圖1所示。可知菌株在不同的碳源中48 h對氨氮的去除率由低到到高的碳源排列是丁二酸鈉、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乙酸鈉、檸檬酸鈉。以檸檬酸鈉為碳源時，在24 h和48 h的氨氮去除率均達到100%，均顯著高于其它組的氨氮去除率，其它組48 h氨氮去除率也明顯高于24 h；當丁二酸鈉為碳源時，24 h和48 h氨氮去除率均低于其他組，差異顯著；當乙酸鈉為碳源時，24 h氨氮去除率低于葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉組，差異顯著，但以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉作為唯一碳源時氨氮去除率差異不顯著；而乙酸鈉組48 h氨氮去除率高于葡萄糖、蔗糖組，差異顯著，也高于可溶性淀粉組，差異不顯著。說明碳源種類差異影響菌株DZYC02氨氮的去除率。

2.3 鹽度、pH及C ∶N對菌株DZYC02脫氮效果的影響

不同鹽度、pH及C ∶N環境中菌株DZYC02脫氨氮效果見圖2。由實驗結果可知，當鹽度由0升

圖1 不同碳源對菌株氨氮去除率的影響Fig.1 Effects of carbon sources on ammonia nitrogen removal rates of strain DZYC02 標有不同小寫字者表示24 h時組間差異顯著;標有相同小寫字母者表示組間差異不顯著；標有不同*者表示48 h時組間差異顯著;標有相同*者表示組間差異不顯著

高到15時，發酵液中氨氮的去除率一直保持100%；當鹽度大于15時，該菌株的脫氮能力開始下降，脫氮率隨著鹽度的升高而降低，當鹽度為30時，該菌株的脫氮率趨于0。

當pH值由4升高到5時，菌株氨氮去除率由(3.2±1.2)%升到的100%。當pH處于5～7時，氨氮去除率維持在(99.9±0.1)%，該pH范圍內3個組間的脫氨氮效果差異不顯著；當pH值由7升高到9時，菌株發酵液中氨氮的去除率顯著下降，脫氮率由(99.8±0.1)%下降到(2.9±0.6)%。表明pH是影響該菌株脫氨氮效果的因子之一，該菌適宜于弱酸環境。

當C ∶N由5提高至15時，發酵液中氨氮的去除率隨C ∶N的升高而顯著增大；當C ∶N在15～30時，各組氨氮去除率均在100%，趨于穩定。

圖2 鹽度、pH及C ∶N對菌株DZYC02脫氮效果的影響Fig.2 Effects of salinity，pH and C ∶N on ammonia nitrogen removal rates of strain DZYC02

2.4 菌株在氨氮及亞硝酸鹽培養基中的生長曲線

菌株DZYC02在氨氮及亞硝酸鹽液體培養基中的生長曲線見圖3。在硝化培養基中，菌株DZYC02在經3 h左右的遲緩期后，進入對數生長期，又經12 h后菌液OD600 nm值增長趨于平緩，隨后進入穩定期。在細菌對數生長期，培養液中的氨氮濃度快速降低，表明細菌增殖過程中可利用培養基中的氨氮。

菌株DZYC02在亞硝氮液體培養基中，經12 h左右的遲緩期后，進入對數生長期；21 h左右又經一次遲緩增殖，到36 h菌株又開始進入對數生長期，到42 h發酵液OD600 nm值達到最大，隨后進入下降趨勢；39 h以后培養基中的亞硝氮濃度仍逐漸降低，至48 h亞硝基氮濃度接近為零，表明細菌增殖過程中可利用培養基中的亞硝基氮。

圖3 菌株在氨氮及亞硝氮培養基中的生長曲線Fig.3 The growth curve of strain DZYC02 in ammonia nitrogen and nitrate nitrogen medium

2.6 菌株的生物安全性

結果顯示，斑馬魚經菌株DZYC02浸泡感染兩周時間內，高濃度實驗組(2.0×108CFU/mL)和低濃度實驗組(2.0×104CFU/mL)及對照組(PBS)的斑馬魚，均未出現死亡，并且在此期間斑馬魚正常攝食，游動活潑。而僅在2.0×105CFU/mL濃度組出現1尾死亡。根據實驗結果綜合判斷，該菌株對斑馬魚不具有感染力。

2.7 菌株鑒定

PCR擴增菌株DZYC02的16S rDNA序列，PCR電泳圖見圖4，將該擴增產物進行序列分析，得1 377 bp的堿基序列(NCBI 登錄號為SUB5864511)，提交到NCBI網站進行BLAST序列比對)，發現該菌與肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae的親緣關系最近，同源性達到99%。選取與該菌源性相近的16株菌的16S rDNA序列構建系統發育樹，結果見圖5，可見該菌與K.pneumoniaesubsp.rhinoscleromatis ATCC 13884菌聚為一類，初步判定該菌為一株克雷伯氏菌K.pneumoniae。Biolog鑒定結果顯示菌株DZYC02與K.pneumoniae的相似度達到 0.615，大于0.5，遺傳距離3.977，小于5。綜合兩種鑒定結果，判定該菌株為一株肺炎克雷伯桿菌。

圖4 菌株DZYC02的16S rDNA 電泳圖Fig.4 PCR products of 16S rDNA gene of bacterial strains DZYC02

3 討論

利用生物脫氮技術進行水質處理已較早用于污水處理行業，近年來生物脫氮技術也被用于水產養殖[9,10]。目前已經發現的脫氮菌種類多，根據其同化作用類型，分為自養硝化細菌、異養硝化細菌[11,12]、自養反硝化細菌、異養反硝化細菌[13,14 ]。而有些脫氮菌兼具有硝化與反硝化能力[12,15 ]，如肺炎克雷伯氏菌為異養硝化好氧反硝化細菌[16]，常見于污水處理系統中，其脫氮特性與攜帶的編碼羥胺氧化酶、周質硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶的基因表達有關[17,18]。有研究表明，異養硝化菌在氨代謝過程中，由氨單氧酶催化氨形成羥胺后，經非血紅素鐵羥胺氧化酶的催化，直接形成N2O及N2[19]，而不同于自養硝化細菌，在氨氧化過程中產生亞硝基氮。

圖5 根據16S rDNA基因序列構建的菌株DZYC02與相近的菌株系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree base on 16S rDNA sequences generated of strain DZYC02 with other similar stains節點數表示bootstrap支持率，1 000次重復.

微生物脫氮過程與環境理化因子及營養物質密切相關，不同的脫氮菌對環境及營養的需求差異較大，適宜的鹽度、溫度、pH、溶解氧及C ∶N等能夠提高脫氮效果[20-24]。有研究發現，從養殖場沉積淤泥中分離的產酸克雷伯菌(K.oxytoca)適宜最佳脫氮條件為pH 7～9，鹽度0～5，當鹽度大于15時不具脫氮效果[25]，且采用不同的碳源，其脫氮效果存在差異。本研究中所分離的菌株DZYC02為一羅非魚循環水養殖池中的菌株，在中性至偏弱酸(pH 5～7)低鹽度(0～15)環境中對氨氮及亞硝基氮具有良好的去除作用，環境中添加適量的碳源可提高該菌的脫氮效果?？芍瑸橐粚俚膬芍昃?，因生存的環境不同，其脫氮條件存在一定的差異。

肺炎克雷伯氏菌屬于腸桿菌科克雷伯氏菌屬，為革蘭氏陰性桿菌，該菌廣泛分布在自然界，因含有多種毒力因子[26]，對人畜均具有致病力[27,28]。肺炎克雷伯氏菌能夠引起團頭魴(Megalobramaamhlycephala)出血性敗血癥[29]，該菌也可從海水魚中分離到[30]。 感染實驗初步證實，本研究中所分離的肺炎克雷伯氏菌為一無毒株，浸泡感染斑馬魚不具有毒力，而在分離該菌的羅非魚循環養殖池中，也未發現養殖羅非魚出現發病的現象，但為了養殖動物的安全，在開發應用該菌前，還需要對該菌對魚類的侵染力、毒力等相關因子開展進一步的研究。