一種復合益生菌對凡納濱對蝦抗副溶血弧菌感染能力的影響*

楊運楷 宋曉玲 王海亮 謝國駟 黃 倢

一種復合益生菌對凡納濱對蝦抗副溶血弧菌感染能力的影響*

楊運楷1,2宋曉玲2①王海亮2謝國駟2黃 倢2

(1. 上海海洋大學 上海 201306；2. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室 青島市海水養(yǎng)殖流行病學與生物安保重點實驗室 青島 266071)

本研究選擇1株地衣芽孢桿菌() BL-9、1株枯草芽孢桿菌() BS-12、1株金麗假交替單胞菌() CDM8，以1∶1∶1將其組成復合益生菌，各益生菌水體添加濃度為107CFU/ml，進行為期30 d的凡納濱對蝦()養(yǎng)殖實驗。實驗分為暫養(yǎng)期(7 d)、益生菌處理期(15 d)、副溶血弧菌()攻毒期(10 d)。結(jié)果顯示，養(yǎng)殖水體中添加復合益生菌能顯著增加水體和對蝦腸道可培養(yǎng)細菌總數(shù)(<0.05)，攻毒實驗結(jié)束時，實驗組對蝦累積存活率為(73.33±6.83)%，顯著高于陽性對照組(25.33±15.43)%。對蝦抗病基因熱激蛋白70 (Heat shock proteins 70,)、β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白-脂蛋白(Beta-1,3-glucan-binding protein-lipoprotein,)、脂多糖-β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白(Lipopolysaccharide-β-1, 3-glucan binding protein,)、抗菌肽在益生菌處理階段均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，在攻毒階段雖呈現(xiàn)各自不同的表達情況，但所有基因都經(jīng)歷了更大幅度上調(diào)。研究表明，水體中添加芽孢桿菌和假交替單胞菌組成的復合益生菌可提高凡納濱對蝦抗副溶血弧菌感染能力，對蝦抗病力的提高可能與益生菌增加對蝦腸道可培養(yǎng)細菌數(shù)量、抗病相關(guān)基因表達水平及過氧化氫酶(CAT)活性有關(guān)。

凡納濱對蝦；復合益生菌；副溶血弧菌；免疫基因；過氧化氫酶

致急性肝胰腺壞死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)是近5年來嚴重危害全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的疫病之一，該病是由攜帶基因的弧菌引起的一類細菌性疾病。目前，已報道的致AHPND弧菌包括副溶血弧菌()、坎貝氏弧菌()、歐文氏弧菌()等(賈丹等, 2018)。本研究所用副溶血弧菌為本實驗室在2013年從廣西患AHPND的凡納濱對蝦()中分離出1株致病性副溶血弧菌(AHPND-causing,AHPND)，編號為20130629002S01。該菌對鹵蟲無節(jié)幼體的半致死濃度(LD50)為2.58×105CFU/ml(王娜等, 2016; 陳蒙蒙等, 2018)。

益生菌是指在一定濃度范圍內(nèi)能夠提高機體健康的活性微生物制劑，作為抗生素及化學藥劑的替代品，在醫(yī)學、食品、養(yǎng)殖等領(lǐng)域已經(jīng)得到了快速的發(fā)展(Balcázar, 2006)。益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的作用機理有以下幾個方面：一是通過細菌自身代謝分解食物或產(chǎn)生消化酶提高機體消化能力；二是競爭性抑制，通過競爭營養(yǎng)、附著位點或合成、分泌抗菌活性因子等來抑制有害微生物的繁殖；三是通過降低水體中的氨氮等有害物質(zhì)改善養(yǎng)殖水環(huán)境；四是通過增強機體免疫功能來提高抗病能力等(Thompson, 1999; Balcázar, 2006)。高戈等(2017)使用巨大芽孢桿菌()進行凡納濱對蝦生物絮團養(yǎng)殖實驗，養(yǎng)殖結(jié)束時，添加巨大芽孢桿菌組的對蝦體長、體重均顯著高于其他2組。張盛靜等(2015)研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加單一益生菌或復合益生菌均可顯著提高對蝦抗副溶血弧菌感染的能力，且復合益生菌的保護效果更佳。

芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用較為廣泛。劉觀斌等(2015)在養(yǎng)殖水體中潑灑適當濃度的枯草芽孢桿菌()可以改善水質(zhì)，提高羅非魚機體的免疫力、抗氧化能力，進而提高羅非魚抗無乳鏈球菌()病的能力。張歡歡等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，生物絮團對蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)中添加菌株02，能改善菌群結(jié)構(gòu)，抑制弧菌生長。作者在前期的研究工作發(fā)現(xiàn)，在凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體中單獨添加107CFU/ml數(shù)量級的地衣芽孢桿菌()BL-9、枯草芽孢桿菌BS-12菌液后，使用副溶血弧菌進行攻毒，實驗組相對于對照組均顯著提高對蝦的成活率。金麗假交替單胞菌()CDM8具有突出的弧菌拮抗能力(Wang, 2018)，在零交換水條件下，能顯著提高凡納濱對蝦ZⅢ幼體和仔蝦PL5的變態(tài)率和成活率(孫博超等, 2019)。因此，本研究選擇上述3株菌組成復合益生菌添加到養(yǎng)殖水體中，評價其對養(yǎng)殖水體及凡納濱對蝦腸道菌群、抗副溶血弧菌感染能力、過氧化氫酶(CAT)活性、抗病基因表達水平的影響，以期為復合益生菌在凡納濱對蝦養(yǎng)殖中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 對蝦與益生菌

1.1.1 實驗用凡納濱對蝦 實驗用凡納濱對蝦購自山東萊州單山水產(chǎn)養(yǎng)殖公司(體長為6.2~10.6 cm)。實驗前參照OIE(2017)水生動物疾病診斷手冊及Wang等(2018)中的PCR方法，進行AHPND病原的套式PCR檢測，結(jié)果為陰性。投喂飼料為寧波天邦飼料有限公司生產(chǎn)的凡納濱對蝦全熟化顆粒飼料，對蝦養(yǎng)殖容器為100 L的PC塑料桶，養(yǎng)殖有效水體為60 L的過濾海水。

1.1.2 實驗用菌種及培養(yǎng) 實驗用菌株：金麗假交替單胞菌CDM8、地衣芽孢桿菌BL-9、枯草芽孢桿菌S-12、副溶血弧菌20130629002S01，均由本實驗室分離、鑒定及保存。

菌液發(fā)酵采用2216E培養(yǎng)基，28℃恒溫震蕩培養(yǎng)，當菌液的OD580 nm≈1時(此時，細菌濃度約為2×109~3×109CFU/ml)，終止發(fā)酵，使用時通過稀釋的方法調(diào)整細菌的水體添加濃度。

CDM8、BL-9、BS-12和副溶血弧菌在水體的添加濃度分別為2.24×107、2.93×107、2.77×107和2.13× 105CFU/ml。

1.2 實驗期及實驗分組

實驗分3個時期：暫養(yǎng)期、益生菌處理期、副溶血弧菌感染期。

暫養(yǎng)期：對蝦不分組，共7 d。期間隨機挑選 12尾凡納濱對蝦進行病原檢測，暫養(yǎng)第7天檢測養(yǎng)殖水體及對蝦腸道可培養(yǎng)細菌數(shù)量，采集對蝦肝胰腺組織用于抗病基因表達及CAT酶活性檢測。暫養(yǎng)穩(wěn)定后，挑選630尾大小均勻、活力良好的對蝦用于后續(xù)實驗。

益生菌處理期：對蝦分為實驗組和對照組。每組7個平行，其中，3個用于統(tǒng)計死亡率，4個用于采樣(對照組為2組，預先設置攻毒階段的陰性和陽性對照組)。實驗組養(yǎng)殖水體中添加復合益生菌，各菌以1∶1∶1比例添加，對照組不添加益生菌。實驗周期為15 d，由于CDM8拮抗能力較強，所以益生菌添加采取交替添加的方式，即3 d為1個添加周期。第1天添加益生菌CDM8菌液，第2天添加BL-9和BS-12菌液，共5個添加周期。在益生菌處理期，第7天和第14天檢測養(yǎng)殖水體及對蝦腸道可培養(yǎng)細菌數(shù)量，采集對蝦肝胰腺組織用于抗病基因表達及酶活性檢測。

副溶血弧菌攻毒期：對蝦分為3組，實驗組、陽性對照組和陰性對照組，每組7個平行，其中，3個用于統(tǒng)計死亡率，4個用于采樣。益生菌處理期，每桶包含對蝦30尾，攻毒期調(diào)整為每桶25尾。實驗組和陽性對照組使用副溶血弧菌浸浴攻毒，先將對蝦于2.13×107CFU/ml副溶血弧菌菌液中浸泡15 min，然后放回，向養(yǎng)殖水體中添加副溶血弧菌菌液使得水體中的弧菌濃度達到2.13×105CFU/ml左右，陰性對照組使用無菌2216E培養(yǎng)基浸浴。副溶血弧菌攻毒期持續(xù)10 d，攻毒期間不添加益生菌。在攻毒的6、18、42、66、90 h采集對蝦的肝胰腺組織進行實驗相關(guān)指標的測量，并統(tǒng)計每天對蝦的累積死亡率。

1.3 實驗管理

實驗期間連續(xù)充氣，水溫控制在(28±1)℃。根據(jù)每天對蝦桶內(nèi)是否有殘餌來調(diào)整投喂量，每天投喂 2次。48 h換水1次，換水量為水體積的2/3。

1.4 樣品及處理

1.4.1 水體和對蝦腸道內(nèi)可培養(yǎng)細菌計數(shù) 水體及對蝦腸道細菌計數(shù)采用2216E瓊脂平板涂布計數(shù)的方式。對蝦腸道活菌計數(shù)，先將對蝦完整腸道加入無菌PBS緩沖液研磨，后進行活菌計數(shù)。

1.4.2 對蝦肝胰腺樣品采集及處理 在各個取樣時間點采集對蝦肝胰腺，每桶取對蝦2尾，每組3個平行，共6尾對蝦。解剖采集的對蝦肝胰腺經(jīng)液氮迅速冷凍后，放置在–80℃超低溫冰箱保存。

1.5 RNA提取及cDNA合成

按TRIZOL Reagent (Invitrogen)說明書進行總RNA的抽提，用Nanodrop 2000c (Thermo)測定RNA濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量后，保存于–80℃?zhèn)溆谩DNA合成采用TaKaRa公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行，使用方式參考試劑盒說明書。

1.6 實時熒光定量PCR

1.6.1 實時熒光定量PCR及引物 使用Fast Essential DNA Green Master熒光定量試劑盒(Roche, 瑞士)進行實時熒光定量PCR檢測，方法參考試劑盒說明書。抗病相關(guān)基因的檢測引物名稱及序列見表1。

1.6.2 熒光定量體系及反應程序 PCR反應體系包括SYBR Premix ExTM(2×) 12.5 μl，cDNA模板1 μl，上下游引物各0.5 μl (10 μmol/L)，DEPC處理水10.5 μl。PCR反應條件：94℃，5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)。每個組織的樣品設3個重復。對實驗結(jié)果采用2?DDCt法進行相對定量分析(Livak, 2001)。

1.7 免疫酶活性檢測

對各組凡納濱對蝦肝胰腺組織進行CAT酶活測定，測定方法參照檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進行。

1.8 數(shù)據(jù)分析與處理

采用SPSS 16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，以Duncan’s多重比較進行不同處理間的顯著性分析，<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌處理期養(yǎng)殖水體及對蝦腸道可培養(yǎng)細菌數(shù)量

養(yǎng)殖水體可培養(yǎng)細菌數(shù)量見圖1A，在添加益生菌前(0 d)，各組水體可培養(yǎng)細菌數(shù)量處于105CFU/ml數(shù)量級(>0.05)。益生菌處理階段第7天和第14天實驗組水體可培養(yǎng)細菌數(shù)量均處于107CFU/ml數(shù)量級，顯著高于對照組(<0.05)。對蝦腸道可培養(yǎng)細菌數(shù)量見圖1B，在添加益生菌前(0 d)凡納濱對蝦腸道細菌總數(shù)在104CFU 數(shù)量級，添加益生菌后實驗組對蝦腸道內(nèi)可培養(yǎng)細菌數(shù)量第7天(3.22×104CFU)，第14天(3.54×104CFU)均顯著高于對照組(第7天為3.04× 104CFU, 第14天為3.03×104CFU) (<0.05)。

2.2 副溶血弧菌攻毒后各組對蝦累積存活率

副溶血弧菌攻毒后取實驗組和陽性對照組瀕死對蝦肝胰腺組織，用TCBS平板涂布培養(yǎng)，長出大量綠色菌落，與攻毒所用副溶血弧菌菌落形態(tài)相同。實驗組和陽性對照組的對蝦均在第18小時開始出現(xiàn)死亡。攻毒后258 h時，實驗組和陰性對照組對蝦的累積存活率分別為73.33%和86.67%，而陽性對照組對蝦的累積存活率為25.33%。實驗組比陽性對照組累積存活率提高了48.00% (表2)。

表1 實時熒光定量PCR所用的引物及序列

Tab.1 Primer sequences used in quantitive real-time PCR

圖1 養(yǎng)殖水體(A)及對蝦腸道(B)可培養(yǎng)細菌總數(shù)

不同字母代表同一時間點不同組之間存在顯著差異，“*”代表同一組之間不同時間點存在顯著差異。下同

Different letters in the same time mean significantly different at 0.05 level (<0.05), “*” means significantly different at 0.05 level in the same group (<0.05). The same as below

2.3 對蝦肝胰腺組織免疫基因相對表達量

2.3.1基因的相對表達量 益生菌處理期，凡納濱對蝦肝胰腺的相對表達量測定結(jié)果見圖2A。第7天和第14天實驗組基因表達量顯著高于對照組(<0.05)。攻毒期，凡納濱對蝦肝胰腺的相對表達量測定結(jié)果見圖2B。實驗組和陽性對照組表達均呈現(xiàn)上升后下降的趨勢，均在18 h達到最大值(<0.05)。

2.3.2基因的相對表達量 益生菌處理期，凡納濱對蝦肝胰腺的相對表達量測定結(jié)果見圖3A，第7天和第14天實驗組基因表達量均顯著高于對照組(<0.05)。攻毒期，凡納濱對蝦肝胰腺的相對表達量測定結(jié)果見圖3B，實驗組對蝦的的表達量呈先升高后下降趨勢，而陽性對照組呈先升高再下降，再升高再下降的趨勢；實驗組和陽性對照組基因的表達量分別在6和66 h達到最高(<0.05)。

2.3.3基因的相對表達量 益生菌處理期，凡納濱對蝦肝胰腺的相對表達量測定結(jié)果見圖4A。實驗組基因表達量在第7天和第14天均顯著高于對照組(<0.05)。攻毒期，凡納濱對蝦肝胰腺的相對表達量測定結(jié)果見圖4B。實驗組和陽性對照組基因的表達均呈先升高后下降的趨勢，實驗組基因表達量在42 h達到最大值，陽性對照組中基因在18 h基因達到最大值。

2.3.4基因的相對表達量 益生菌處理期，凡納濱對蝦肝胰腺的相對表達量測定結(jié)果見圖5A，實驗組表達量在第7天顯著高于對照組，而在第14天時表達量則低于對照組的(<0.05)。攻毒期，凡納濱對蝦肝胰腺的相對表達量測定結(jié)果見圖5B，實驗組和陽性對照組基因的表達量均呈先升高后下降的趨勢，攻毒42 h以后，實驗組對蝦的表達量高于陽性對照組(<0.05)。

表2 凡納濱對蝦感染副溶血弧菌后累積存活率

Tab.2 Accumulative survival rate of L. vannamei post V. parahaemolyticus challenge (%; n=3; ±SD)

注：同列中數(shù)據(jù)后面不同字母表示顯著性差異(<0.05)

Note: Different letters in the same column mean significantly different (<0.05)

圖2 凡納濱對蝦肝胰腺中Hsp70基因的相對表達量

A：益生菌處理階段；B：攻毒階段

A: Probiotics immersion period; B:AHPNDinfection period

圖3 凡納濱對蝦肝胰腺中βGBP-HDL基因的相對表達量

A：益生菌處理階段；B：攻毒階段

A: Probiotics immersion period; B:AHPNDinfection period

圖4 凡納濱對蝦肝胰腺中Crustin基因的相對表達量

A：益生菌處理階段；B：攻毒階段

A: Probiotics immersion period; B:AHPNDinfection period

2.3.5 過氧化氫酶(CAT)活性 益生菌處理期，凡納濱對蝦肝胰腺CAT活性的測定結(jié)果見圖6A，實驗組CAT活性顯著高于對照組的(<0.05)，呈逐漸升高趨勢。攻毒期，凡納濱對蝦肝胰腺CAT活性的測定結(jié)果見圖6B，實驗組從第18小時開始呈逐漸升高的趨勢，而陽性對照組呈先升高后下降、再升高再下降的趨勢。

A：益生菌處理階段；B：攻毒階段

A: Probiotics immersion period; B:AHPNDinfection period

圖6 凡納濱對蝦肝胰腺CAT活性

A：益生菌處理階段；B：攻毒階段

A: Probiotics immersion period; B:AHPNDinfection period

3 討論

Wu等(2008)研究表明，益生菌可以在對蝦腸道內(nèi)復雜的環(huán)境中競爭有限的生態(tài)位點，阻止致病微生物在該位點定植與繁殖。競爭性抑制是益生菌通過與腸道上皮細胞發(fā)生反應，與致病菌競爭腸道黏膜表面結(jié)合位點，進而抑制致病菌在腸道內(nèi)的黏附和定植，是益生菌的益生機制之一(廖文艷等, 2011)。本研究中，實驗組水體可培養(yǎng)細菌總數(shù)顯著高于對照組，且實驗組對蝦腸道可培養(yǎng)細菌總數(shù)也顯著高于對照組，說明添加益生菌不僅對養(yǎng)殖水體可培養(yǎng)細菌總數(shù)產(chǎn)生影響，同時，也影響對蝦腸道可培養(yǎng)細菌總數(shù)。類似地，胡毅等(2008)研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加枯草芽孢桿菌能顯著增加凡納濱對蝦腸道細菌總數(shù)，且與對照組相比飼料中添加益生菌在實驗前期和末期均顯著降低了對蝦腸道的弧菌數(shù)量。劉文亮等(2017)在凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體中投喂含有蠟樣芽胞桿菌()的飼料，用16S rDNA序列V3+V4區(qū)高通量測序方法檢測對蝦腸道內(nèi)微生物群落的結(jié)構(gòu)及變化，結(jié)果表明，飼料中添加蠟樣芽孢桿菌投喂凡納濱對蝦后，可改變對蝦腸道的微生物組成，提高凡納濱對蝦生長速度、增強抗病能力。本研究攻毒階段實驗組對蝦相對于陽性對照組對蝦累積存活率提高了48.00%，說明復合益生菌能夠提高對蝦抗副溶血弧菌感染能力，這可能與益生菌增加對蝦腸道可培養(yǎng)細菌總數(shù)有關(guān)。由于本研究取樣次數(shù)較多，導致每次取樣的對蝦樣本量偏少，對蝦腸道可培養(yǎng)細菌數(shù)量增多并不足以說明對蝦腸道菌落結(jié)構(gòu)的變化。益生菌是否在凡納濱對蝦體內(nèi)定植還有待進一步探索。

LGBP作為一種模式識別受體能夠識別革蘭氏陰性菌和真菌細胞壁的脂多糖和β-1,3-葡聚糖，并通過激活ProPO系統(tǒng)發(fā)揮作用，它是甲殼動物對抗副溶血弧菌感染的一個重要免疫因子(王錫波等, 2013)；與LGBP功能類似，βGBP-HDL在激活ProPO系統(tǒng)、凝結(jié)過程等方面起著重要作用(王春迪等, 2016)。本研究中，益生菌處理階段，在第7天均出現(xiàn)不同程度上調(diào)，孫艷等(2012)研究也發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦在含益生菌的飼料飼喂對蝦過程中表達上調(diào)，并在72 h時達到最大值，與本研究結(jié)果類似。攻毒階段，實驗組的表達始終顯著高于陰性對照組，陽性對照組的則在攻毒后第66小時低于陰性對照組，且攻毒42 h后，實驗組表達始終高于陽性對照組；而實驗組的在攻毒后前42 h顯著高于陽性對照組。分析實驗結(jié)果，水體添加復合益生菌不同程度的促進了表達，說明復合益生菌在凡納濱對蝦抵抗副溶血弧菌侵染的過程中發(fā)揮了積極的作用。

HSP作為一種對環(huán)境應激敏感的蛋白，在外界環(huán)境刺激下其表達量會明顯增加，參與到細胞保護機制中，對保證正常的細胞結(jié)構(gòu)，維持機體新陳代謝具有重要意義(明建華等, 2009)。本研究攻毒階段，實驗組和陽性對照組表達均呈先上升后下降的趨勢，但實驗組基因表達量顯著高于陽性對照組，說明養(yǎng)殖水體添加益生菌后，相比陽性對照組實驗對蝦抗應激反應能力更強。類似的研究，王春迪等(2016)在養(yǎng)殖水體中添加蠟樣芽胞桿菌后，用WSSV感染凡納濱對蝦，實驗組對蝦在第96小時表達量顯著高于對照組。水體添加高濃度副溶血弧菌攻毒能引起對蝦的應激反應，而本研究結(jié)果表明，副溶血弧菌攻毒時，復合益生菌能夠提高凡納濱對蝦抗應激反應的能力。

抗菌肽(Antimicrobial peptides, AMPs)是一種原始的具有防御功能的生物分子，目前主要包括：ALFs、Crustins、Peneidins三大類以及一些血藍蛋白、溶菌酶、C型外源凝集素等(Antony, 2011)。本實驗中益生菌處理階段，實驗組在第7天和第14天的表達量均高于對照組，說明水體添加益生菌能促進表達。攻毒階段，實驗組和陽性對照組的表達均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，陽性對照組在第18小時達到最大，實驗組在第42小時達到最大。趙偉等(2017)用副溶血弧菌攻毒發(fā)現(xiàn)，攻毒后的實驗組對蝦呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并在攻毒的第12小時達到最大，跟本研究陽性對照組實驗結(jié)果類似。攻毒后，副溶血弧菌對對蝦機體造成傷害，短時間內(nèi)的迅速表達能夠抵抗副溶血弧菌的入侵。研究表明，復合益生菌增強對蝦抗副溶血弧菌入侵的能力，可能與攻毒后復合益生菌延緩對蝦基因的表達有關(guān)。

氫氧自由基(OH-, ROS)是化學性質(zhì)最活潑的活性氧，它幾乎與細胞內(nèi)的每一類有機物如糖、氨基酸、磷脂、核苷酸和有機酸發(fā)生反應，其破壞性極強(Liu, 2010)。當副溶血弧菌侵入凡納濱對蝦體內(nèi)時，會激發(fā)對蝦天然免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生ROS以對抗弧菌的入侵，雖然釋放ROS是甲殼動物對抗微生物感染的重要防御機制，產(chǎn)生過量同時會導致細胞損傷，但它可以被過氧化氫酶分解(Duan, 2015)。本研究益生菌處理階段，復合益生菌能夠顯著提高對蝦CAT活性。桂琳等(2015)研究也發(fā)現(xiàn)，水體添加復合益生菌能顯著提高草魚()血清中CAT活性。本研究攻毒階段，陽性對照組CAT活性呈上升、下降、再上升、再下降的趨勢。趙偉等(2017)使用副溶血弧菌攻毒，36 h內(nèi)觀察對凡納濱對蝦CAT的影響，發(fā)現(xiàn)實驗組凡納濱對蝦肝胰腺CAT活性呈先升高后降低的趨勢，與本研究陽性對照組結(jié)果相似，說明副溶血弧菌對凡納濱對蝦的這種天然免疫系統(tǒng)造成了破壞；而本研究中，實驗組CAT活性則呈逐漸上升的趨勢，這種逐漸上升的趨勢說明實驗組對蝦的這種免疫機制仍然完善。分析實驗結(jié)果，益生菌增強對蝦抗弧菌感染能力，可能與益生菌能夠提高對蝦的CAT活性有關(guān)。

4 結(jié)論

凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體中添加的復合益生菌能顯著提高對蝦感染副溶血弧菌后的成活率，增加水體和對蝦腸道中可培養(yǎng)細菌量。在益生菌處理時期，復合益生菌能夠不同程度的提高對蝦抗病相關(guān)基因的表達量和CAT活性；副溶血弧菌攻毒時期，對蝦抗病相關(guān)基因表達呈現(xiàn)各自不同的情況。實驗結(jié)果表明，復合益生菌提高凡納濱對蝦抗副溶血弧菌感染能力的原因可能與復合益生菌增加水體和對蝦腸道中可培養(yǎng)細菌量、提高凡納濱對蝦抗病相關(guān)基因表達和CAT活性有關(guān)。

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Effect of A Compound Probiotics on the Ability ofto ResistInfection

YANG Yunkai1,2, SONG Xiaoling2①, WANG Hailiang2, XIE Guosi2, HUANG Jie2

(1.Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao); Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Qingdao Key Laboratory of Mariculture Epidemiology and Biosecurity, Qingdao 266071)

In thisculture experiments of, we explore the effect of compound probiotics on the ability ofto resistinfection at different experimental stages. One strain of(BL-9), one(BS-12), and one(CDM8) were selected to make up a compound of probiotics at the same concentration (107CFU/ml). The effect of compound probiotics on theinfection ofwas observed by adding the compound probiotics to the culture water of the. The experiment took place over 30 d, including a temporary period (7 d), a probiotics immersion period (15 d), and ainfection period (10 d). The experiment results showed that the addition of compound probiotics in the culture water could significantly increase the total number of bacteria culture in the water and the intestinal tract of(<0.05). The cumulative survival rate of shrimp in the experimental group was (73.33±6.83)% at the end of the infection periodwhich was significantly higher than that of the positive control group (25.33±15.43)%. The disease-resistant-related gene: heat shock protein 70 (), β-1,3-glucan binding protein-lipoprotein (), lipopolysaccharide-β-1, 3-glucan binding protein(),, and immune related enzymes catalase (CAT), was up-regulated by different degrees in the probiotics immersion phase. And all the genes up-regulated extensively during theinfection stage, but expressed at different levels. The results suggested that the compound probiotics with BL-9, BS-12, and CDM8 in water could improve the ability of shrimp to resistinfection. The increase of disease resistance ofmay be related to the colonization of probiotics in the intestinal tract, and the expression level of disease resistance related genes and catalase activity inIt is hoped that the results of this study can provide a reference for the application of compound probiotics in the cultivation of.

; Compound probiotics;; Immune genes; Catalase

SONG Xiaoling, E-mail: songxl@ysfri.ac.cn

* 中國水產(chǎn)科學研究院基本科研業(yè)務費專項(2017HY-ZD0502; 2017HY-ZD1002)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-47)共同資助[This work was supported by Special Scientific Research Funds for Central Non-Profit Institutes, Chinese Academy of Fishery Sciences (2017HY-ZD0502; 2017HY-ZD1002), and China Agriculture Research System (CARS-47)]. 楊運楷，E-mail: 891293238@qq.com

宋曉玲，研究員，E-mail: songxl@ysfri.ac.cn

2019-03-17,

2019-04-09

S945

A

2095-9869(2020)03-0133-09

10.19663/j.issn2095-9869.20190317001

http://www.yykxjz.cn/

楊運楷, 宋曉玲, 王海亮, 謝國駟, 黃倢. 一種復合益生菌對凡納濱對蝦抗副溶血弧菌感染能力的影響. 漁業(yè)科學進展, 2020, 41(3): 133–141

Yang YK, Song XL, Wang HL, Xie GS, Huang J. Effect of a compound probiotics on the ability ofto resistinfection. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(3): 133–141

(編輯 馬璀艷)