半滑舌鰨甘露糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶1基因的克隆及表達(dá)分析*

王 倩 張 雪 陳亞?wèn)| 沙珍霞,2

半滑舌鰨甘露糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶1基因的克隆及表達(dá)分析*

王 倩1張 雪1陳亞?wèn)|2,3沙珍霞1,2①

(1. 青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071;3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

甘露糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶1 (Mannan-binding lectin associated serine protease 1, MASP1)是補(bǔ)體凝集素途徑中起重要作用的激活蛋白。本研究以半滑舌鰨()為研究對(duì)象，應(yīng)用RACE技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR技術(shù)對(duì)半滑舌鰨1基因(11)進(jìn)行了克隆和表達(dá)模式分析。結(jié)果顯示，1基因cDNA序列全長(zhǎng)為2507 bp，5′非編碼區(qū)長(zhǎng)82 bp，3′非編碼區(qū)長(zhǎng)142 bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)2283 bp，共編碼760個(gè)氨基酸；1基因包含13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子，與多數(shù)已知魚(yú)類(lèi)的1基因結(jié)構(gòu)一致；SMART分析顯示，CsMASP1包含6個(gè)結(jié)構(gòu)域，與哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)、其他魚(yú)類(lèi)的結(jié)構(gòu)域一致；同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，CsMASP1和魚(yú)類(lèi)的相似度較高，與金目鱸()的相似性最高，為76%。1基因在11種健康組織(血液、腦、鰓、性腺、心臟、頭腎、腸、肝、皮膚、脾和后腎)中均有表達(dá)，其中，在肝、脾和頭腎中表達(dá)量較高；鰻弧菌()感染后，1基因在6種免疫組織(血液、鰓、頭腎、腸、肝和脾)中呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式，在6種免疫組織中呈現(xiàn)明顯的上調(diào)表達(dá)，肝的表達(dá)峰值出現(xiàn)在感染后24 h；脾和鰓的表達(dá)峰值出現(xiàn)在感染后6 h；腸、頭腎和血液的表達(dá)峰值均出現(xiàn)在感染后12 h；隨著病原菌感染時(shí)間增加，基因表達(dá)量逐漸降低并恢復(fù)至正常水平。研究表明，1基因參與了半滑舌鰨的免疫應(yīng)答過(guò)程，本結(jié)果為半滑舌鰨的免疫機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。

半滑舌鰨；1基因；基因克隆；基因表達(dá)；免疫應(yīng)答

甘露糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶1(MASP1)屬于絲氨酸蛋白酶(Serine proteases, SP)超家族成員，包括MASP1(Takahashi, 2013)、MASP2(Swierzko, 2014)和MASP3(Dahl, 2001)。MASP1是補(bǔ)體凝集素途徑中起重要作用的激活蛋白，MASP1可被甘露糖結(jié)合凝集素(Mannan-binding lectin, MBL)激活以響應(yīng)病原體感染，MBL-MASP復(fù)合物共同激活凝集素途徑(Sunyer, 1998; Schwaebl, 2002)。

目前，關(guān)于MASP1的研究相對(duì)較少，2000年首次在人中克隆鑒定出1(Chen, 2000)，隨后構(gòu)建了人的MASP1 N端片段原核表達(dá)載體并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)(Cai, 2008)。迄今僅在文昌魚(yú)()(Endo, 2003)、七鰓鰻()(Endo, 2003)、草魚(yú)()(Dang, 2017)和菊海鞘()(Nicola, 2017)等水生生物中開(kāi)展了1的克隆表達(dá)及免疫應(yīng)答相關(guān)研究。硬骨魚(yú)MASP1的研究還極為有限。

半滑舌鰨()是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)。近年來(lái)，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的快速發(fā)展，病害問(wèn)題特別是弧菌病對(duì)半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。有關(guān)半滑舌鰨免疫機(jī)制的研究和有效的病害防控手段還有待深入研究(Chen, 2015)。本研究通過(guò)PCR技術(shù)克隆了1基因的cDNA，并分析了其基因結(jié)構(gòu)及其進(jìn)化關(guān)系，還研究了1基因在半滑舌鰨11種健康組織中的表達(dá)特征，及鰻弧菌感染后該基因在6種免疫組織中的時(shí)空表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步深入了解1基因在半滑舌鰨免疫防御中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

半滑舌鰨購(gòu)自山東海陽(yáng)黃海水產(chǎn)有限公司，魚(yú)齡為2齡左右，平均體重為(400±5) g，平均體長(zhǎng)為(40.3±0.1) cm。健康實(shí)驗(yàn)魚(yú)在24℃水族箱中暫養(yǎng)7 d，每天換新鮮滅菌海水，盡量消除環(huán)境脅迫。鰻弧菌為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種，經(jīng)16S rRNA測(cè)序進(jìn)行菌種鑒定。

1.2 樣品處理和采集

隨機(jī)選取3條健康的半滑舌鰨，分別采集每條魚(yú)的血液、腦、鰓、性腺、心臟、頭腎、腸、肝、皮膚、脾和后腎共11種組織，并立即投入液氮中冷凍，然后轉(zhuǎn)移至–80℃冰箱保存，用于總RNA提取。鰻弧菌感染參照(Sha, 2017)實(shí)驗(yàn)方法略作修改，采用腹腔注射方法對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行鰻弧菌感染，感染劑量(半致死劑量)為3.18×105CFU/g魚(yú)體，對(duì)照組注射相同體積的無(wú)菌PBS溶液。在注射后0、6、12、24、48和72 h共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3條魚(yú)，分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的血液、鰓、頭腎、腸、肝臟和脾臟6種組織，保存方式同上所述。

1.3 RNA提取和cDNA制備

采用液氮研磨收集的組織，按照RNA提取試劑盒(天根，北京)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行組織總RNA提取。提取的RNA用瓊脂糖凝膠電泳(1.00%)檢測(cè)其完整性。用Agilent 2100 biological analyzer (Applied Biosystems, 美國(guó))檢測(cè)其純度和濃度。按照PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, 大連)試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，–20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 CsMASP1基因的cDNA序列的擴(kuò)增

通過(guò)對(duì)半滑舌鰨轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選了1基因的部分cDNA序列，并對(duì)該序列設(shè)計(jì)特異性引物P1和P2(表1)，以半滑舌鰨11個(gè)組織混合cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(20 μl)：Trans?HiFi Polymerase (5 U/μl) 0.2 μl, 10×TransHiFi BufferⅡ2 μl, 2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μl, P1 1 μl, P2 1 μl, cDNA模板2 μl, ddH2O 12.2 μl。反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，38個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。1.00%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用DNA膠回收試劑盒(諾唯贊, 南京)純化PCR擴(kuò)增特異性產(chǎn)物，連接到pEASY-T1(全式金, 北京)載體上，重組載體轉(zhuǎn)化到1感受態(tài)細(xì)胞(全式金, 北京)中，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證后測(cè)序(上海派森諾生物科技有限公司)。在克隆獲得的序列5′端和3′端設(shè)計(jì)RACE (Rapid-Amplification of cDNA Ends)引物P3和P5(表1)和巢式特異性引物P4和P6(表1)，使用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(TaKaRa, 大連)獲得該基因的5′和3′端序列，將克隆的序列進(jìn)行拼接獲得1基因的cDNA全長(zhǎng)序列。

表1 半滑舌鰨1基因克隆和表達(dá)分析所用引物

Tab.1 PCR primers used for cloning and expression analysis of MASP1

1.5 CsMASP1基因序列分析

將1的全長(zhǎng)cDNA序列提交到NCBI網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，利用BLAST程序進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)，利用ORF Finder (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找開(kāi)放閱讀框，并推導(dǎo)其相應(yīng)的氨基酸序列；采用SMART(Simple Modular Architecture Research Tool)在線(xiàn)軟件分析CsMASP1蛋白的結(jié)構(gòu)域，利用ExPASy軟件(http://www.expasy.org)預(yù)測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)；用SignalP 4.0 Server (http://www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/)軟件分析CsMASP1蛋白的信號(hào)肽。應(yīng)用Splign(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Ostell/Spidey/)在線(xiàn)軟件確定1基因的內(nèi)含子與外顯子的數(shù)目，分析不同物種1的基因結(jié)構(gòu)以及其所在染色體的位置。

1.6 MASP1同源比對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

從GenBank中查詢(xún)不同物種1基因的氨基酸序列，采用DNAMAN軟件進(jìn)行不同物種的MASP1蛋白的氨基酸序列多重比對(duì)，用MEGA 6.0軟件中的Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.7 CsMASP1基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量分析

根據(jù)1基因設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物P7和P8(表1)，以半滑舌鰨18S rRNA基因?yàn)閮?nèi)參設(shè)計(jì)特異引物Cs18s-F和Cs18s-R (表1)。基因?qū)崟r(shí)定量表達(dá)參照已報(bào)道的方法進(jìn)行(Lu, 2013; Yu, 2017)。使用ChamQTMSYBR?Color qPCR Master Mix試劑(諾唯贊, 南京)，按照說(shuō)明書(shū)于A(yíng)pplied Biosystems 7500 Real Time PCR儀上進(jìn)行該基因的實(shí)時(shí)定量分析(qRT-PCR)。反應(yīng)體系為20 μl：10 μl 2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix，1 μl模板cDNA，0.4 μl引物P7，0.4 μl引物P8，0.4 μl 50×ROX Reference Dye 2，7.8 μl ddH2O。反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃ 3 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線(xiàn)95℃ 15 s；60℃ 1 min；95℃ 15 s。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，采用2–ΔΔCt方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，值取3個(gè)平行樣品的平均值。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)的Duncan法對(duì)多組樣本平均值進(jìn)行兩兩比較分析，<0.05時(shí)，認(rèn)為存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 CsMASP1基因序列分析和結(jié)構(gòu)特征

克隆獲得的1基因cDNA序列全長(zhǎng)為2507 bp (登錄號(hào)：XM_008309208.2)，5′非編碼區(qū)(Untranslated Region, UTR, 5′ UTR)長(zhǎng)82 bp，3′ UTR長(zhǎng)142 bp，開(kāi)放閱讀框(Open reading frame, ORF)長(zhǎng)2283 bp (圖1)。推測(cè)CsMASP1編碼氨基酸為760個(gè)，預(yù)測(cè)其分子量為84.95 kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為5.33。SignalP 4.0 Server分析顯示，此氨基酸序列無(wú)信號(hào)肽。SMART軟件分析顯示，CsMASP1蛋白含6個(gè)結(jié)構(gòu)域：分別是2個(gè)類(lèi)Clr/Cls蛋白(like Clr/Cls Protein domain, CUB)結(jié)構(gòu)域(47~168 aa, 215~327 aa)，1個(gè)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子樣(Calcium-binding epidermal growth factor-like domain, EGF-CA)結(jié)構(gòu)域(169~212 aa)，2個(gè)補(bǔ)體控制蛋白區(qū)(Complement control protein domain, CCP)結(jié)構(gòu)域(331~392 aa, 397~461 aa)和1個(gè)絲氨酸蛋白激酶區(qū)(Serine protease domain, SP)Tryp-SPc結(jié)構(gòu)域(478~752 aa) (圖2)。

利用Splign軟件分析了7個(gè)物種的1基因結(jié)構(gòu)并進(jìn)行了比較(圖3)，它們是半滑舌鰨(XM_ 008309208.2)、劍尾魚(yú)()(XM_ 023351221.1)、大黃魚(yú)()(XM_ 027280128.1)、斑馬魚(yú)()(XM_001341900. 6)、馬() (XM_001499629.5)、人()(NM_001879.5)和中國(guó)倉(cāng)鼠() (XM_003495604.2)。結(jié)果顯示，1含13個(gè)外顯子，位于4號(hào)染色體上；劍尾魚(yú)1含13個(gè)外顯子，位于18號(hào)染色體上；大黃魚(yú)1含13個(gè)外顯子，位于7號(hào)染色體上；斑馬魚(yú)1含12個(gè)外顯子，位于15號(hào)染色體上；馬1含16個(gè)外顯子，位于19號(hào)染色體上；人1含16個(gè)外顯子，位于3號(hào)染色體上；中國(guó)倉(cāng)鼠1含15個(gè)外顯子，位于4號(hào)染色體上。半滑舌鰨1基因結(jié)構(gòu)與多數(shù)已知魚(yú)類(lèi)(劍尾魚(yú)和大黃魚(yú))一致，與哺乳類(lèi)(人、馬和中國(guó)倉(cāng)鼠)在外顯子數(shù)目上有差異，說(shuō)明該基因在魚(yú)類(lèi)保守。

2.2 半滑舌鰨與其他物種MASP1同源比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過(guò)BLAST比對(duì)，將CsMASP1氨基酸序列(XP_008307430.1)與金目鱸()(XP_ 018560455.1)、牙鲆()(XP_ 019966501.1)、黃鱔()(XP_020477488.1)、伯氏樸麗魚(yú)()(XP_014184888.1)、非洲爪蟾()(AAI70221.1)、海龜()(EMP37646.1)、紅喉潛鳥(niǎo)() (XP_009815055.1)、皇帝企鵝() (KFM09600.1)、白鷺()(XP_009633907.1)、西伯利亞虎() (XP_015393589.1)、羊駝()(XP_ 006201039.1)、馬(XP_ 005601936.1)、中國(guó)倉(cāng)鼠(XP_007606939.1)、人(XP_ 016862358.1)的MASP1氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，相似性范圍為76%~42%。其中，CsMASP1與金目鱸的相似性最高，為76%；而與中國(guó)倉(cāng)鼠的相似性最低，為42%。將半滑舌鰨和其他13個(gè)物種MASP1的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，可以看出不同物種MASP1存在高度保守的氨基酸殘基，如圖4所示，保守氨基酸出現(xiàn)在絲氨酸蛋白酶活性中心處：組氨酸His526、天冬氨酸Asp582和絲氨酸Ser705，這3個(gè)氨基酸的保守定位對(duì)于維持絲氨酸蛋白酶的活性是十分重要的。

推導(dǎo)的氨基酸序列顯示在核苷酸序列下方，用大寫(xiě)字母表示。方框所示為起始密碼子(ATG)、星號(hào)(*)所示為終止密碼子(TGA)；實(shí)線(xiàn)()所示為CUB結(jié)構(gòu)域；圓點(diǎn)線(xiàn)()所示為EGF-CA結(jié)構(gòu)域；短劃線(xiàn)()所示為CCP結(jié)構(gòu)域；雙劃線(xiàn)()所示為T(mén)ryp-SPc結(jié)構(gòu)域；波浪線(xiàn)()所示為poly A結(jié)構(gòu)

Translated amino acid sequence was shown under the nucleotide sequence as uppercase. The iniation codon and termination codon were marked by a box and an asterisk, respectively; CUBdomain was shown in solid line(); EGF-CA domain was shown in dot line();CCPdomain was shown in dashed line();Tryp-SPcdomain was shown in double solid line(); poly A was shown in wavy line()

利用MEGA 6.0軟件對(duì)上述各個(gè)物種的MASP1氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖5)。結(jié)果顯示，半滑舌鰨與伯氏樸麗魚(yú)、金目鱸和黃鱔等魚(yú)類(lèi)的MASP1聚為一支。兩棲類(lèi)海龜和非洲爪蟾、鳥(niǎo)類(lèi)白鷺、皇帝企鵝和紅喉潛鳥(niǎo)，哺乳類(lèi)馬、西伯利亞虎、羊駝、人和中國(guó)倉(cāng)鼠等動(dòng)物的MASP1聚為一支。但兩棲類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳類(lèi)又按親緣關(guān)系遠(yuǎn)近聚成相應(yīng)的亞類(lèi)。MASP1在進(jìn)化上與伯氏樸麗魚(yú)的親緣關(guān)系最近，與哺乳類(lèi)、爬行類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)等動(dòng)物的MASP1的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。從進(jìn)化的結(jié)果看，幾個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的支持率較高，均在90%以上。例如：金目鱸和黃鱔，半滑舌鰨和伯氏樸麗魚(yú)這幾個(gè)物種聚類(lèi)為一個(gè)分支，支持率分別為98%和100%。

圖2 半滑舌鰨 MASP1 蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

SMART軟件在線(xiàn)預(yù)測(cè)CsMASP1蛋白的結(jié)構(gòu)域，CsMASP1包含6個(gè)結(jié)構(gòu)域，從C端到N端分別是CUB結(jié)構(gòu)域(47~168 aa), EGF-CA結(jié)構(gòu)域(169~212aa), CUB結(jié)構(gòu)域(215~327 aa),CCP結(jié)構(gòu)域(331~392 aa),CCP結(jié)構(gòu)域(397~461 aa), Tryp-SPc結(jié)構(gòu)域(478~752 aa)

SMART software predicts the domain of CsMASP1 protein online. CsMASP1 contains six domains:CUB domain (47~168 aa), EGF-CA domain (169~212 aa), CUB domain (215~327 aa), CCP domain (331~392 aa),CCP domain (397~461 aa), Tryp-SPc domain (478~752 aa)

圖3 不同物種的MASP1基因結(jié)構(gòu)比較

7個(gè)物種的1基因結(jié)構(gòu)圖，各個(gè)物種的1基因序列號(hào)與所在染色體基因組序列號(hào)分別為：人NM_001879.5, NG_029440.1;馬XM_001499629.5, NC_009162.3; 中國(guó)倉(cāng)鼠M_003495604.2, NW_003613596.1; 劍尾魚(yú)XM_023351221.1, NC_036460.1; 大黃魚(yú)XM_027280128.1, NC_040017.1; 半滑舌鰨XM_008309208.2, NC_024310.1; 斑馬魚(yú)XM_001341900.6, NC_007126.7

The sequence numbers of the1 gene and the genome numbers of the chromosomes in seven species were as follows:NM_001879.5, NG_029440.1;XM_001499629.5, NC_009162.3;M_003495604.2, NW_003613596.1;XM_023351221.1, NC_036460.1;XM_027280128.1, NC_040017.1;XM_008309208.2, NC_024310.1;XM_001341900.6, NC_007126.7

圖4 半滑舌鰨和其他物種MASP1氨基酸序列的多重比對(duì)

MASP1氨基酸序列比對(duì)，絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域中保守氨基酸用黑框標(biāo)出：組氨酸His526、天冬氨酸Asp582和絲氨酸Ser705

Amino acid sequence alignment of MASP1, conservative amino acids in serine protease domain were marked by the black box: His526, Asp582and Ser705

圖5 MEGA 6.0軟件構(gòu)建的基于MASP1氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 CsMASP1基因在健康組織中的表達(dá)分析

利用qRT-PCR分析1基因在11種健康組織中的表達(dá)特征。結(jié)果顯示，1基因在血液、腦、鰓、性腺、心臟、頭腎、腸、肝、皮膚、脾和后腎中均有表達(dá)；其中，肝中相對(duì)表達(dá)量最高(185.4)，其次為脾(138.1)和頭腎(76.2)，在腦、心臟、血液、腸、后腎、性腺、皮膚和鰓中表達(dá)量較低且表達(dá)量依次降低(圖6)。

2.4 鰻弧菌感染后CsMASP1基因在免疫組織中的表達(dá)分析

鰻弧菌感染半滑舌鰨后可誘導(dǎo)1在免疫組織中的表達(dá)變化，在感染0、6、12、24、48、72 h后，1在PBS對(duì)照組和感染組半滑舌鰨的血液、鰓、頭腎、腸、肝和脾6種免疫組織中的表達(dá)水平如圖7所示。1基因表達(dá)總體趨勢(shì)表現(xiàn)為先升高后降低。在脾和鰓中，1基因的表達(dá)呈現(xiàn)相同的上調(diào)趨勢(shì)，其表達(dá)峰值出現(xiàn)在鰻弧菌感染后6 h，在脾中為對(duì)照組表達(dá)量的15.4倍；在鰓中則是對(duì)照組的4.6倍；在肝中1基因表達(dá)上調(diào)，最大表達(dá)量出現(xiàn)在感染后24 h，是對(duì)照組的12.4倍；在腸中1基因表達(dá)上調(diào)，最大表達(dá)量出現(xiàn)在感染后12 h，是對(duì)照組的7.7倍，72 h時(shí)依然保持較高的表達(dá)水平；在頭腎和血液中，1基因的表達(dá)峰值均出現(xiàn)在鰻弧菌感染后12 h，在頭腎中為對(duì)照組表達(dá)量的9.7倍；在血液中則是對(duì)照組的6.8倍；隨后基因表達(dá)量逐漸下降至略低于正常水平值。

3 討論

3.1 CsMASP1基因cDNA的克隆及序列分析

甘露聚糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶是機(jī)體重要的天然免疫防御分子，通過(guò)激活補(bǔ)體和調(diào)理吞噬2種方式來(lái)清除病原體(Chen, 2000)。MASP1是形成C4bC2a轉(zhuǎn)化酶的必要因子，是凝集素激活途徑中的特異性啟動(dòng)酶(Oroszlan, 2016)。MASP最初是作為與Complement component 1s(Cls)功能相似可以裂解C4和C2的一種新型絲氨酸蛋白酶被發(fā)現(xiàn)的(Matsushita, 1992)。鑒于MASP與Cls相似，推測(cè)MBL-MASP1-MASP2與C1q-C1r2-C1s2相似，因此，MASP1和MASP2可能分別與類(lèi)Complement component 1r (Clr)和類(lèi)C1s絲氨酸蛋白酶有相似的功能(Matsushita, 1998、2000)。雖然在硬骨魚(yú)的免疫系統(tǒng)中已經(jīng)鑒定出了1，但其對(duì)細(xì)菌感染的免疫功能尚不清楚(Endo, 2003; Dang, 2017)。本研究成功克隆了1基因，預(yù)測(cè)其編碼蛋白的分子量為84.95 kDa，與已報(bào)道的草魚(yú)MASP1 (Dang, 2017)的分子量和人MASP1 (Matsushita, 1998)的分子量類(lèi)似。MASP1編碼的氨基酸序列經(jīng)SignalP軟件預(yù)測(cè)無(wú)信號(hào)肽，而草魚(yú)MASP1蛋白序列中包含一段19 aa的信號(hào)肽(Dang, 2017)。研究表明，MASP的SP區(qū)(Serine protease domain)是催化功能區(qū)，含有所有絲氨酸蛋白酶活性中心高度保守的組氨酸(His)、丙氨酸(Asp)和絲氨酸(Ser)等3個(gè)氨基酸殘基，與MASP的絲氨酸蛋白酶活性有關(guān)(Wallis, 2000、2007)。在本研究中，SMART結(jié)果顯示，MASP1含有6個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是2個(gè)CUB結(jié)構(gòu)域(47~168 aa, 215~327 aa)、1個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域(169~212 aa)、2個(gè)CCP結(jié)構(gòu)域(331~392 aa, 397~461 aa)和1個(gè)Tryp-SPc結(jié)構(gòu)域(478~752 aa)。與文獻(xiàn)報(bào)道的人MASP1(Matsushita, 1998; Stover, 2001; Dobo, 2016)結(jié)構(gòu)域相同，與草魚(yú)MASP1(Dang, 2017)結(jié)構(gòu)域也相同。絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(SP)活性中心有1個(gè)典型的組氨酸環(huán)。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域完全相似，組氨酸His526、天冬氨酸Asp582和絲氨酸Ser705定位相當(dāng)保守，與文獻(xiàn)報(bào)道的文昌魚(yú)和七鰓鰻(Endo, 2003)的比對(duì)結(jié)果一致，說(shuō)明該活性中心在進(jìn)化上相對(duì)保守。這些特性與MASP/C1r/C1s家族的進(jìn)化相關(guān)(Jia, 2003)。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，MASP1與伯氏樸麗魚(yú)MASP1親緣關(guān)系最近，與金目鱸和黃鱔等魚(yú)類(lèi)的MASP1親緣關(guān)系次之。

圖6 CsMASP1基因在半滑舌鰨健康組織中的相對(duì)表達(dá)量

Bl: 血液；Br：腦；Gi：鰓；Go：性腺；He：心臟；HK：頭腎；In：腸；Li：肝；Sk：皮膚；Sp：脾；TK：后腎。字母“a, b, c”代表SPSS多重分析的不同分組，有相同字母表示差異不顯著(>0.05)，無(wú)相同字母表示差異顯著(<0.05)；下同

Bl: Blood; Br: Brain; Gi: Gills; Go: Gonad; He: Heart; Hk: Head kidney; In: Intestine; Li: Liver; Sk: Skin; Sp: Spleen; Tk: Trunk kidney. The letters of ‘a(chǎn), b, and c’ indicated the Duncan grouping in SPSS 19.0 software. The same letters indicate no significant difference (>0.05), the different letters indicate significant difference (<0.05); the same applies below

圖7 鰻弧菌感染半滑舌鰨后不同時(shí)間點(diǎn)6種組織(血液、鰓、頭腎、腸、肝和脾)中CsMASP1基因的相對(duì)表達(dá)水平

3.2 CsMASP1在健康組織和鰻弧菌感染后的免疫組織中的表達(dá)分析

本研究利用qRT-PCR檢測(cè)1在半滑舌鰨11種健康組織和感染后6種免疫組織中的表達(dá)譜，結(jié)果顯示，在所檢測(cè)的11種組織中分布廣泛且具有組織特異性，在肝中表達(dá)水平最高，脾中表達(dá)水平次之，在頭腎中的表達(dá)相對(duì)其他組織也較高，推測(cè)其可能在免疫調(diào)控中發(fā)揮作用。與草魚(yú)的分布結(jié)果不相同，草魚(yú)1在心臟中表達(dá)水平最高，在肝和腦中表達(dá)水平次之(Dang, 2017)。

MASP1是構(gòu)成先天性免疫防御體系的重要成員之一(Ammitzboll, 2013)。本研究報(bào)道了1參與鰻弧菌感染后機(jī)體反應(yīng)的免疫應(yīng)答。鰻弧菌感染半滑舌鰨72 h內(nèi)，1在血液、鰓、頭腎、腸、肝和脾組織中均出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的情況，總體趨勢(shì)表現(xiàn)為表達(dá)量先升高，達(dá)到一個(gè)峰值后，隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸降低恢復(fù)至正常水平，說(shuō)明1在病原入侵后參與了機(jī)體的免疫應(yīng)答。鰓和腸中的1表達(dá)量在鰻弧菌感染后6 h大幅上調(diào)，鰓在6 h達(dá)到最大值，腸比鰓稍微滯后，腸在12 h達(dá)到最高峰，分別是對(duì)照組的7.7倍和4.6倍，隨后下降到與對(duì)照組無(wú)顯著差異。腸是最大的免疫器官，腸上分布著大量的腸相關(guān)淋巴組織，腸道組織和鰓是腹腔注射鰻弧菌后直接接觸的部位，所以腸和鰓1的表達(dá)量均先于其他免疫組織上調(diào)。隨后，病原菌進(jìn)入其他免疫組織，激活其他免疫組織1基因的表達(dá)。與Dang等(2017)研究發(fā)現(xiàn)草魚(yú)感染嗜水氣單胞菌后，草魚(yú)1在鰓和腸中表達(dá)量短時(shí)快速增加結(jié)果相一致；但草魚(yú)1在腸中感染后4、24、72 h顯示3個(gè)表達(dá)高峰與本研究的結(jié)果不太一致，推測(cè)草魚(yú)1在腸中感染后出現(xiàn)3個(gè)峰值可能是由于感染菌不同，也可能是由于魚(yú)體差異等。脾1的表達(dá)量隨著時(shí)間增加而增加，在感染6 h后達(dá)到最大值，約是對(duì)照組的15倍，是所有免疫組織中增量最高的組織；這與腎、脾是魚(yú)類(lèi)免疫細(xì)胞生成的主要場(chǎng)所，也是產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要部位這一觀(guān)點(diǎn)是一致的(Wang, 2018)。6種免疫組織表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式可能與不同時(shí)間點(diǎn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，在我們之前的研究中，感染后，補(bǔ)體激活途徑、凝血級(jí)聯(lián)激活途徑和弧菌感染相關(guān)途徑均被激活來(lái)抵御病原菌的入侵(Zhang, 2015)。1在免疫組織中的高表達(dá)暗示了1在機(jī)體免疫反應(yīng)中可能發(fā)揮著重要作用。本結(jié)果為深入研究1基因在半滑舌鰨免疫防御系統(tǒng)中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and Expression Analysis of the1 Gene from the Half-Smooth Tongue Sole ()

WANG Qian1, ZHANG Xue1, CHEN Yadong2,3, SHA Zhenxia1,2①

(1. College of Life Science, Qingdao University, Qingdao 266071; 2. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, PilotNational Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071; 3. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory for Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao 266071)

Mannan-binding lectin-associated serine protease 1 (MBL associated serine protease 1, MASP1) is an important activator in the complement lectin pathway. In this study, the cDNA of the1 gene from(1) was cloned using a RACE method based on the partial sequence of1, and gene expression was performed by qRT-PCR. The results showed that the full length of cDNA was 2507 bp in size, including a 5′-untranslated region (UTR) of 82 bp, 3′-UTR of 142 bp, and a complete open reading frame (ORF) of 2283 bp, encoding 760 amino acids. The theoretical isoelectric point (pI) of the predicted protein was 5.33 and the molecular weight was 84.95 kDa. Homologous alignment showed that the amino acids sequence of1 had a high identity with those of other species, approximately 42%~76%. The1 gene was expressed in all tested tissues (liver, intestine, spleen, head-kidney, gill, blood, brain, skin, heart, trunk-kidney, and gonad) in the healthyand the highest expression was in the liver (185.4). To study the expression patterns of the1 gene in an immune response, the specific expression of1 was performed afterinfection. The results showed that the expression of the1 gene was up-regulated in the liver, gill, blood, intestine, head-kidney, and spleen afterinfection. The most significantly up-regulated expression and the peak level at 6 h reached 15.4 times baseline in the spleen. The results indicate that the1 genes are involved in the immune response.

;1; Gene cloning; Gene expression; Immune response

S971.4

A

2095-9869(2020)03-0049-11

10.19663/j.issn2095-9869.20190122002

沙珍霞，教授，E-mail: shazhenxia@163.com

2019-01-22,

2019-03-09

* 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31572644)資助 [This work was supported by National Natural Science Foundation of China (31572644)]. 王 倩，E-mail: qianwangqd@163.com

http://www.yykxjz.cn/

王倩, 張雪, 陳亞?wèn)|, 沙珍霞. 半滑舌鰨甘露糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶1基因的克隆及表達(dá)分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(3): 49–59

Wang Q, Zhang X, Chen YD, Sha ZX. Cloning and expression analysis of the1 gene from the half-smooth tongue sole (). Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(3): 49–59

SHA Zhenxia, E-mail: shazhenxia@163.com

(編輯 馮小花)