“徐香”獼猴桃離體快繁研究

趙文娟，吳杰新，張漢堯

（西南林業大學西南地區生物多樣性保育國家林業局重點實驗室，云南昆明650224）

徐香獼猴桃是獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）多年生落葉藤本植物[1]。果實內不僅含有獼猴桃堿、蛋白水解酶、單寧、果膠和糖類等有機物質，還含有人體所需的17 種氨基酸和豐富的維生素C、檸檬酸、果糖、葡萄酸、蘋果酸和鈣、鋅、硒、鍺、鉀等微量元素，營養價值高，市場前景良好。中國的獼猴桃產業不斷擴大，市場應用前景廣闊；廣大顧客對獼猴桃苗的需求量也越來越大[2]。傳統的獼猴桃繁殖方式主要采用種子播種，或采用實生苗作為砧木嫁接，育種周期長且產量較低；通過播種育苗，種子出苗率較低，還會引起后代性狀變異；通過嫁接繁殖又會有砧木和接穗不親和障礙、病毒復合感染的問題；而植物組織培養則利用細胞具有全能性的特點，通過離體器官的組織培養，降低了育苗成本；整個過程具有培養條件可控、生長周期短、繁殖力高、管理方便等優點；建立徐香獼猴桃的無菌體系，既能使其優良性狀得以保存，又能大量培育出組培苗[3]。在生產生活中，可以用組培苗進行抗性篩選研究，得到能夠抵御不良環境的徐香苗，提高育種效率，從而更好地應用于生產實踐。本次實驗對離體的徐香獼猴桃葉片進行培養，保存徐香獼猴桃的優良性狀；因此，以植物組織培養技術為基礎的離體快速繁殖技術將成為獼猴桃重要的良種繁育途徑[4～5]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實驗所需的外植體材料為西南林業大學溫室大棚栽培的徐香獼猴桃嫩葉，或是通過室內水培的復幼嫩葉；實驗及組織培養在西南林業大學西南地區生物多樣性保育國家林業局重點實驗室進行，組培室培養條件如下：光照采用日光燈光源，光照強度2000 Lux；溫度 24 ℃；濕度 60%。

1.2 實驗方法

1.2.1 MS 培養基的配制

空白培養基采用MS 培養基配方配制，培養基中加入 MS 粉 4.4 g/L，蔗糖 30 g/L，瓊脂 4.5 g/L，用電磁爐煮沸水直至瓊脂融化，將pH 值調至5.8。在壓強98 kPa、溫度121 ℃的條件下，滅菌21 min。

1.2.2 無菌體系的建立

選擇無病蟲害的根萌條、健康且生長旺盛的徐香獼猴桃嫩葉作為外植體。外植體消毒時，試驗采用L9（23）正交實驗篩選最佳消毒配方，其中因素1 為75%酒精的浸泡時間，3 個水平依次為 10 s、15 s、20 s；因素2 為0.1%升汞的浸泡時間，3 個水平分別是1 min、2 min、3 min；每個處理重復 3 次，每個重復 10 瓶。觀察不同處理的生長情況，15 d 后統計污染葉片數（片）和褐化葉片數（片）。

1.2.3 愈傷組織誘導

實驗使用細胞分裂素TDZ 和生長素IBA 在無菌體系建立的基礎上，采用L9（23）正交實驗篩選最佳誘導愈傷配比。因素1 為TDZ 的濃度，3 個水平分別是1 mg/L、1.5 mg/L、2 mg/L；因素 2 為 IBA 的濃度，3 個水平分別是 0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L；每個處理重復3 次，每個重復10 瓶。30 d 后統計形成愈傷組織的情況。

1.2.4 不定芽分化誘導

選擇6-BA 和NAA 作為本實驗不定芽誘導的細胞分裂素，將生長良好的愈傷組織轉接到不定芽誘導的培養瓶中，采用L9（23）正交實驗篩選最佳不定芽誘導配方。其中因素1 為6-BA 的濃度，3 個水平分別為1 mg/L、1.5 mg/L、2 mg/L；因素 2 為 NAA 的濃度，3 個水平分別為 0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L，且每個處理重復3 次，每個重復10 瓶。30 d 后統計不定芽的分化結果，統計不定芽分化的愈傷數量（株），平均出芽數（株），平均苗高（cm）。

1.2.5 生根誘導

生根誘導時使用1/2 MS 培養基，同樣采用L9（23）正交實驗篩選最佳生根配方。其中因素1 為IBA 的濃度，3 個水平分別為 0.5 mg/L、0.75 mg/L、1 mg/L；因素2 為 AC 的濃度，3 個水平分別為 0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L，且每個處理重復3 次，每個重復10 瓶。第7 d 起開始觀察接入組培苗的生根情況，于第30 d 統計生根的株數、根長（cm）、計算生根率（%）。

1.2.6 煉苗與移栽

將長勢旺盛，生根正常的組培苗移至自然光下生長，10 d 后開始慢慢松動瓶蓋，15 d 后將組培瓶的瓶蓋打開并用紗布掩住，20 d 后取出組培苗用流水將附著于根上的培養基沖洗干凈，并用多菌靈溶液進行消毒泡洗5 min，之后在陰涼環境下晾干表面水分，栽種到經多菌靈殺毒處理過的不同配比的土壤基質中。實驗選用的基質為腐殖土、生土、草炭土、珍珠巖，4 種基質比處理 1 為 1∶1 ∶1 ∶1、處理 2 為 2 ∶1 ∶1 ∶1、處理 3 為 3 ∶1 ∶1∶1、處理 4 為 4 ∶1 ∶1 ∶1。每個配方移栽 10 株生根苗，3 次重復。放置于陰涼處，用塑料薄膜或蓋子將其蓋住，保持溫度在（26±3）℃，噴施水霧濕度控制在80%以上。20 d 后統計苗的長勢情況，如是否健壯，有無萎蔫等。

2 結果與分析

2.1 不同消毒方法對徐香獼猴桃外植體的影響

表1 顯示，外植體消毒的平均污染率在2.8%～88.9%，其中平均污染率最低的是處理8；平均成活率在7.8%～96.1%。平均成活率最高的是處理8，最低的是處理3。這說明0.1%升汞和75%酒精對外植體均有消毒效果，且消毒效果隨酒精消毒時間的增加而增加，隨0.1%升汞消毒時間的增加而呈現出先增后減的趨勢；因此當75%酒精處理時間不足，0.1%升汞處理時間過長時（處理2）平均污染率高達88.9%；而適當的增加75%酒精消毒時長，外植體的平均污染率又有逐步降低的趨勢，處理8 污染率降低至2.8%，同時外植體的成活率隨升汞消毒滅菌時間的增加呈現出逐步減小的趨勢，這與升汞消毒滅菌時對外植體細胞產生的毒害作用有關。不難看出，處理8 的消毒效果最好。

表1 徐香獼猴桃外植體各處理消毒效果

表2 外植體各處理消毒方差分析

如表2 所示，外植體消毒9 個處理間的污染率（P=0＜0.01）差異極顯著；褐化率（P=0＜0.01）呈現極顯著差異，成活率（P=0＜0.01）也有極顯著差異。

2.2 不同生長激素對徐香獼猴桃愈傷組織形成的影響

如表3 所示，30 d 后觀察9 個處理的愈傷形成情況，平均死亡率在0%～74.5%，平均存活率在22.5%～92.5%，愈傷組織的形成率在29.2%～100%。其中平均存活率最高是處理6，高達92.5%；其愈傷形成率也最高，為100%，說明處理6 易誘導形成愈傷組織。

如表4 所示，愈傷組織誘導9 個處理間的褐化率（P=0＜0.01）呈現極顯著差異，成活率（P=0＜0.01）也有極顯著差異。

表3 不同生長激素對徐香獼猴桃愈傷組織形成的影響

表4 愈傷組織誘導各處理的方差分析

2.3 不定芽誘導激素對徐香獼猴桃不定芽增殖的影響

如表5 所示，不定芽誘導平均株高9 個處理為0.5～1.77 cm，平均芽數0.86～9.62 個/株。其中處理9的平均株高最高，為1.77 cm，且其平均芽數也多，為9.62 個/株。

如表6 所示，不定芽誘導激素9 個處理間的平均芽高（P=0＜0.01）有極顯著差異；平均芽數（P=0.001＜0.01）呈現極顯著差異。

表5 不定芽誘導激素各處理效果

表6 不定芽誘導激素各處理方差分析

2.4 不同生根處理對徐香獼猴桃生根的影響

表7 表明，9 個生根處理的生根率在 46.7%～98.3%，平均根長在4.9～9.4 cm。其中，處理9 誘導生根效果最好，平均生根率可達98.3%，且誘導生長的根長最長，已達9.4 cm。

表7 不同生根處理對徐香獼猴桃生根的影響

如表8 所示，9 個處理間的生根率（P=0＜0.01）有極顯著差異；生根數（P=0＜0.01）呈現極顯著差異，根長（P=0＜0.01）也有極顯著差異。

表8 不同生根處理方差分析

2.5 不同基質配比對徐香獼猴桃煉苗成活率的影響

如表9 所示，4 個處理生長成活率較高的是處理4，即腐殖土 ∶生土 ∶草炭土 ∶珍珠巖為 4 ∶1 ∶1 ∶1 時，苗木生長情況較其他處理更綠，苗木生長也比較健壯。

表9 不同基質配比對徐香獼猴桃煉苗成活率的影響

3 討論

通過實驗，得出最佳的外植體滅菌方法為流水沖洗30 min+75%酒精消毒20 s+0.1%升汞消毒2 min。75%的酒精滅菌消毒時間在外植體消毒殺菌過程中有著主要作用。當75%酒精處理20 s 時，可得到最佳的消毒滅菌效果，時間過短會增加外植體污染率；0.1%升汞消毒2 min 又優于消毒1 min 和3 min，這和葛新玲得出的最佳外植體消毒時間不同，葛新玲通過建立獼猴桃再生體系，得出最佳的酒精處理時間為10～15 s，然后用升汞處理8 min[6]，這可能由于外界環境和外植體本身差異導致；0.1%升汞對外植體的消毒效果隨消毒時間的增加出現先增后減的趨勢，這和馬歡[7]外植體消毒滅菌方法得出的結論相一致。

周紅菊[8]用歐亞旋覆花為材料，探究了TDZ 在用葉片、根部誘導形成愈傷組織時得出，當培養基中加入TDZ 0.05 mg/L 時，歐亞旋覆花的根部長出的愈傷組織較好，且分化較快，愈傷組織分化率達到100%，分化出來的愈傷組織也有光澤。而潘偉明[9]采用環割進行壓條時的實驗結果表明，IBA 溶液對獼猴桃愈傷組織的形成有促進作用，且濃度越高效果越好。

本次實驗表明，愈傷組織誘導效果最好的是當激素濃度TDZ 1.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L 時，污染率最低，成活率達到92.5%，愈傷形成率可達100%。其中，IBA 的濃度作用效果與潘偉明得出的結論相符；最適宜誘導愈傷組織生長的TDZ 濃度與周紅菊得出的結論不符，可能是由于實驗材料、環境及其操作人員的不同造成。實驗顯示，當激素濃度為IBA 1 mg/L+AC 0.3 g/L 時，不定芽生根率較高，平均生根率可達98.3%，且誘導生根后根生長較好。王大平[10]對獼猴桃組織培養苗生根條件進行研究得出，最佳生根誘導培養基為1/2MS+IBA 1.0 mg/L+0.3%活性炭，與本實驗結果相似。