大豆蛋白熱聚集體的溶液行為表征

王冬梅 范志軍 安然 王中江

摘 要：研究不同熱處理溫度對大豆蛋白熱聚集體溶液行為的影響。結果表明，隨著熱處理溫度的升高，大豆蛋白形成了可溶性聚集體，隨著聚集體粒徑和分子量的逐漸增大，濁度顯著增加。60 ℃和80 ℃熱誘導聚集體以單個分子顆粒形式存在，而100 ℃熱誘導聚集體呈小尺寸粒子。

關鍵詞：大豆蛋白;熱處理溫度;溶液行為

Abstract：The effect of different heat treatment temperature on the behavior of soybean protein thermal aggregate solution was studied. The results showed that with the increase of heat treatment temperature， the particle size and molecular weight of soybean protein increased gradually because of the formation of soluble aggregates. Turbidity increased significantly. Heat induced aggregates at 60 ℃ and 80 ℃ are in the form of single molecular particles， while heat induced aggregates at 100 ℃ are in the form of small particles.

Key words：Soybean protein; Heat treatment temperature; Solution behavior

通過加熱使蛋白質變性并聚集在一起形成聚集體的現象稱為蛋白質的熱聚集行為，會引起蛋白質功能特性的變化[1]，空間結構變化，對功能特性和食品品質產生嚴重影響。由此可見，研究熱處理溫度對大豆蛋白熱聚集行為的影響對于理解蛋白變性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大豆分離蛋白采購自山東萬得福實業有限公司，蛋白質含量約92.11%。乙醇、NaOH等實驗試劑均為分析純。

1.2 實驗設備

本實驗所用儀器設備如表1所示。

1.3 試驗方法

1.3.1 大豆分離蛋白可溶性熱聚集體的制備

先在大豆分離蛋白中加入10 mmol·L-1，pH為7.0的磷酸緩沖液，制成質量濃度為5%的樣品溶液，然后在4 ℃下以9 000 r·min-1的速率離心處理30 min，取其上清液于帶塞三角瓶中，而后在60、80、100 ℃條件下水浴處理30 min，在4 ℃下以9 000 r·min-1的速率離心處理30 min，取其上清液用0.45 ?m過濾膜過濾，經過干燥后，在4 ℃下儲存即可。

1.3.2 動態光散射

測定蛋白質粒徑常采用Zetasizer Nano ZS納米粒度分布儀。利用pH為7.0、濃度為10 mmol·L-1的磷酸緩沖液將樣品蛋白稀釋至2 mg·mL-1，4 ℃下以10 000 r·min-1的轉速離心20 min。提取上清液，過醋酸纖維膜（0.45 μm），25 ℃下采用粒度分布儀測定溶液內蛋白分子粒徑的分布，取3次測量平均值進行繪圖。

1.3.3 溶解度

將濃度為2 mg·mL-1的樣品分散在磷酸鹽緩沖液（pH7.0、10 mmol·L-1）中，在室溫下攪拌，2 h后離心（12 000 r·min-1，4 ℃，20 min）。取上清液過0.45 ?m濾膜，利用BCA測定法測定上清液的蛋白含量。利用此方法測得的上清液蛋白質量與樣品總蛋白質量的比值即為蛋白質的溶解度，計算公式如式（1）所示。

1.3.4 濁度

利用pH 7.0，10 mmol·L-1的磷酸緩沖液將樣品稀釋至蛋白濃度為2 mg·mL-1，經過2 h的溶解后，常采用分光光度計在500 nm測定蛋白質溶液的吸光度即為濁度。

1.3.5 體積排阻色譜

采用體積排阻色譜法分析蛋白質分子量分布情況。用Waters 2487高效液相泵和1525紫外檢測器組成WATERS高效液相系統，而分析柱采用TSK G4000SW。洗脫液為100 mmol·L-1 pH為7.0的磷酸緩沖液（流速0.5 mL·min-1），采用濾膜（0.45 μm）抽濾后，超聲脫氣30 min。2 mg·mL-1的蛋白溶液經過濾、抽濾后上樣，以恒定的流速洗脫，然后在220 nm下測定吸光值。洗脫時的流動速度為0.3 mL·min-1。標準蛋白有γ球蛋白（158 kDa）、肌紅蛋白（16 951 Da）、卵清蛋白（44 287 Da）、牛血清白蛋白（66 kDa）與維生素B12（1 355.37 Da）。

2 結果與分析

2.1 熱處理對大豆蛋白可溶性聚集體粒徑的影響

如圖1，提高熱處理溫度會使大豆蛋白粒徑增大，形成大粒徑尺寸（>1 000 nm）的蛋白熱聚集體。由于熱處理使大豆蛋白疏水基團暴露，分子間的疏水作用增強，導致粒徑增大。溫度達到100 ℃時，在10 nm處出現一個小粒徑單體峰，并且相比較60 ℃和80 ℃加熱處理的大粒徑尺寸蛋白熱聚集體的峰強呈減弱趨勢，高溫熱處理導致大粒徑聚集體熱解聚形成了小分子粒徑蛋白聚集體[2-3]。

2.2 熱處理對大豆蛋白可溶性聚集體分子量分布的影響

圖2為標準的蛋白分子量分布曲線圖，由圖3可知，熱處理溫度升高，蛋白聚集體的分子量分布峰（5～10 min）面積逐漸變大，表明大分子大豆蛋白可溶性熱聚集體含量逐漸增加。而較高熱處理下大豆球蛋白的分子量分布峰有所降低，表明大豆球蛋白的亞基參與了蛋白的可溶性熱聚集[4-5]。

2.3 熱處理對大豆蛋白可溶性聚集體濁度的影響

濁度是表征蛋白質溶液穩定性及聚集程度的關鍵指標[5]。濁度值能夠側面反映蛋白在溶液中的分散狀態、粒徑尺寸及溶解度大小[5]。如圖4，大豆蛋白經熱處理后，濁度明顯變大（P<0.05），進一步表明隨著熱處理溫度的升高，大豆蛋白聚集形成了可溶性蛋白聚集體。

3 結論

隨著熱處理溫度的升高，大豆蛋白形成了可溶性聚集體，粒徑和分子量逐漸增大。濁度顯著增加。60 ℃和80 ℃熱誘導聚集體以單個分子顆粒狀形式存在，而100 ℃熱誘導聚集體呈小尺寸粒子形式。

參考文獻：

[1]Castellania O，David B E.Effect of aggregation and sodium salt on emulsifying properties of egg yolk phosvitin[J]. Food Hydrocolloids，2005，19（4）：769-776.

[2]安 然.大豆分離蛋白可溶性熱聚集行為及其超聲調控研究[D].哈爾濱：東北農業大學，2019.

[3]李向紅，華欲飛，裘愛泳，等.體積排阻色譜和激光光散射對大豆蛋白熱誘導聚集體的研究[J].中國油脂，2007，32（2）：74-77.

[4]郭鳳仙.熱處理對大豆分離蛋白結構及功能特性的影響[D].無錫：江南大學，2009.

[5]袁德保.大豆蛋白熱聚集行為及其機理研究[D].廣州：華南理工大學，2010.