三種地生蘭根際真菌的分離與檢測

范繼紅　陳蘭芬　湯久楊

摘要：選取蘭屬的春蘭、春劍和寒蘭3種地生蘭，對其栽培基質中的根際真菌進行分離培養后得到3個優勢菌株，并以18SDNA序列擴增鑒定為米根霉（Rhizopus oryaze）、球毛殼菌（Chaetomium lobasum）、小孢根霉（Rhizopus icrosporus），通過對蘭花根系進行染色顯微觀察，發現蘭花根與真菌共生形成的菌根結構，為蘭科植物根際真菌研究提供了理論依據。

關鍵詞：地生蘭;根際真菌;分離;檢測

中圖分類號：S682.31? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）04-0088-03

Abstract： Three Chinese terrestrial orchids Cymbidium goeringii， Cymbidium tortisepalum Fukuy.var. longibracteatum and Cymbidium kanran were chosen to the samples for isolating and culturing rhizosphere fungi from substrates， which found and identificated three preponderant fungal strains during the storage， and which identified as Rhizopus oryaze， Chaetomium lobasum， Rhizopus icrosporus by 18SDNA sequences. It was found that the roots of orchid were mutualized with fungi to form rhizosphere structure， according to orchid roots stained and microscopical observed， so as to provide a theoretical basis for further research of orchids rhizosphere fungi.

Key words： orchid; rhizosphere fungi; separate; testing

蘭科（Orchidaceae）是有花植物中最大的科，全世界蘭科植物約有26 000種，廣泛分布于各種陸地生態系統中[1]。菌根（Mycorrhiza）作為自然界中極為普遍和重要的共生現象，是植物在長期生存進化過程中與菌根真菌一起協同進化的產物[2]。幾乎所有的蘭科植物都與真菌共生，蘭科菌根共生關系幾乎伴隨著蘭科植物從種子萌發到開花結果的整個生活史[3]，大多數成年的蘭科植物仍需菌根真菌提供生長所需的碳水化合物及有機質，如氨基酸、維生素等[4]。

本試驗選取蘭屬的春蘭[Cymbidium goeringii （Rchb. f.） Rchb. f.]、春劍（Cymbidium tortisepalum Fukuy. var. longibracteata）和寒蘭（Cymbidium kanran）3種地生蘭，對其栽培基質中的根際菌群進行分離培養得到3個優勢菌株，并以18SDNA方法擴增進行鑒定。通過對蘭花根系染色顯微觀察，發現了蘭花根與真菌共生形成的菌根結構，以期為研究蘭花根際真菌提供理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 供試植物

供試植物：春蘭，采集地為貴州省黔西南州興義市;春劍，采集地為四川省雅安市;寒蘭，采集地為福建省漳州市。

1.2? 栽培基質

栽培基質采用松樹皮基質，采購于北京大漢園景科技有限公司，顆粒大小大約2 cm2，基質采用松樹皮+草炭+珍珠巖混合，混合比例為松樹皮∶草炭∶珍珠巖=1∶1∶1。

1.3? 種苗栽培

栽植盆選用塑料盆，規格為上口徑15 cm，盆底直徑12 cm，高15 cm，栽培前修剪爛根、空根，待根系變軟發白后再栽入盆中，每10 d澆水一次，每隔一月澆一次花多多氮磷鉀三元復合肥（氮∶磷∶鉀為20∶20∶20）營養液。

1.4? 試驗方法

菌種分離Czapek培養基，根際菌種類型鑒定采用18SDNA序列測序，菌根侵染狀況采用KOH透明-藍墨水染色法測定，菌根侵染率以被侵染的根段數占鏡檢總根段數的百分率表示。

2? 結果與分析

2.1? 3種國蘭栽培基質根際菌種分離

通過Czapek培養基接種培養，發現3種優勢菌株，將3種優勢菌株分離培養后進行18SDNA序列測序，確定3個優勢菌株分別為米根霉（Rhizopus oryaze）、小孢根霉（Rhizopus icrosporus）、球毛殼菌（Chaetomium lobasum）（表1、圖1）。從表1可以看出，春蘭、春劍、寒蘭3種國蘭均發現了米根霉，屬于優勢菌種;在春蘭和寒蘭中都分離出了球毛殼菌，可以歸為亞優勢種或伴生種;小孢根霉僅在春劍中發現，需要進一步試驗確認其在蘭花生長中的作用。從圖1可以看出，在對菌種培養過程中，每種培養基上都出現了2種不同的菌落，春蘭和寒蘭均以米根霉白色菌絲為主，春劍中米根霉和小孢根霉分布比較平均。

2.2? 3種國蘭根內菌根結構及侵染率觀察

通過取樣鏡檢發現，3種蘭花的根系都發現了菌根結構，春蘭發現的菌根結構主要為細胞內的聚生結構，數量較多，春劍和寒蘭的菌根結構主要發現的是細胞間菌絲較多，菌絲粗大，分支不明顯，在與細胞的侵染點處有明顯的分支。通過鏡檢計數，春蘭的菌根感染率比較高，達到35%（圖2至圖4）。

通過鏡檢計數，3種國蘭的菌根侵染率均在30%以上，其中春蘭的菌根感染率比較高，達到35%，寒蘭的菌根感染率為32%，春劍的菌根感染率為30%。

3? 小結與討論

蘭科植物是典型的菌根植物，不僅在種子萌發階段與真菌有著密不可分的聯系，在幼苗和成年期仍需要真菌為其提供營養，蘭科植物在生長的不同時期需要不同的真菌與其共生。

本試驗分離出的3個菌株都屬于腐生菌類的根霉屬和毛殼菌屬，根霉屬為毛霉科真菌中的一個大屬，廣泛分布于酒曲、植物殘體、腐敗有機物、動物糞便和土壤中，還沒發現關于根霉與蘭花形成的菌根。毛殼菌屬是腐生子囊菌中數量最多和意義較大的類群之一，毛殼菌的大多數種類都有降解纖維素的能力，某些類群還具有重要的醫用價值，已有關于從石斛蘭中分離到毛殼菌的報道[5]。本試驗分離到的3個菌株是否是與蘭花形成的菌根有待進一步接種試驗驗證。

通過染色鏡檢觀察到了蘭花根系的細胞內菌絲團和胞間菌絲狀況，侵染率大約都在30%左右。菌根結構簡單，侵染率不是很高，可能與使用人工加工的松樹皮栽培基質微生物類群簡單有關。

參考文獻：

[1] 蓋雪鴿，邢曉科，郭順星.蘭科菌根的生態學研究進展[J].菌物學報，2014，33（4）：753-767.

[2] 李曉林，馮? 固.叢枝菌根生理生態[M].北京：華文出版社，2001.

[3] DEARNALEY J D W. Further advances in orchid mycorrhizal research[J].Mycorrhiza，2007，17： 475-486.

[4] SMITH S E，READ D. Mycorrhizal symbiosis，3rd edition[M].New York：Elsevier，2008.

[5] 李? 明.蘭花菌根研究及應用[M].昆明：云南大學出版社，2006.