IGF-1、mtDNA及膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ水平在盆底器官脫垂患者組織表達研究

陳春經 林煥明

【摘要】 目的：研究胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、線粒體DNA（mtDNA）及膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ在盆底器官脫垂（POP）患者的組織表達。方法：收集筆者所在醫院POP患者50例作為研究組，同時選擇同期行子宮切除術的良性非POP患者50例作為對照組。比較兩組mtDNA、膠原蛋白Ⅰ mRNA、膠原蛋白Ⅲ mRNA相對密度值，以及IGF-1、膠原蛋白Ⅰ蛋白、膠原蛋白Ⅲ蛋白灰度值。結果：研究組mtDNA、膠原蛋白Ⅰ mRNA、膠原蛋白Ⅲ mRNA相對密度值分別為（0.41±0.09）、（0.47±0.08）、（0.56±0.11），均低于對照組的（0.85±0.11）、（0.92±0.13）、（0.93±0.12），差異有統計學意義（P<0.05）。研究組IGF-1、膠原蛋白Ⅰ蛋白、膠原蛋白Ⅲ蛋白灰度值分別為（3.36±0.12）、（5.44±0.18）、（5.16±0.13），均低于對照組的（4.49±0.14）、（7.17±0.19）、（6.87±0.15），差異有統計學意義（P<0.05）。結論：POP患者宮骶韌帶-子宮主韌帶的mtDNA、膠原蛋白ⅠmRNA、膠原蛋白Ⅲ mRNA及IGF-1、膠原蛋白Ⅰ蛋白、膠原蛋白Ⅲ蛋白表達均為下調趨勢，可能參與了POP的發生、發展。

【關鍵詞】 盆底器官脫垂 胰島素樣生長因子-1 線粒體DNA 膠原蛋白Ⅰ 膠原蛋白Ⅲ

[Abstract] Objective： To study the expression of insulin-like growth factor-1 （IGF-1）， mitochondrial DNA （mtDNA） and collagen Ⅰ， Ⅲ in the tissues of patients with pelvic organ prolapse（POP）. Method： A total of 50 POP patients in our hospital were collected as the study group， and 50 benign non-POP patients who underwent hysterectomy at the same time were selected as the control group. The relative density values of mtDNA， collagen Ⅰ mRNA and collagen Ⅲ mRNA， and the gray value of IGF-1， collagen Ⅰ protein， collagen Ⅲ protein were compared between the two groups. Result： The relative density values of mtDNA， collagen Ⅰ mRNA， collagen Ⅲ mRNA in the study group were （0.41±0.09）， （0.47±0.08） and （0.56±0.11）， which were lower than （0.85±0.11）， （0.92±0.13） and （0.93±0.12） in the control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The gray values of IGF-1， collagen Ⅰ proteins， collagen Ⅲ proteins in the study group were （3.36±0.12）， （5.44±0.18） and （5.16±0.13）， which were lower than （4.49±0.14）， （7.17±0.19） and （6.87±0.15） in the control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： The level of mtDNA， collagen Ⅰ mRNA， collagen Ⅲ mRNA and IGF-1， collagen Ⅰ protein， and collagen Ⅲ protein expressions of uterosacral ligament-uterine main ligament in POP patients are all down-regulated， which may be involved in the occurrence and development of POP.

盆底器官脫垂（POP）主要是由于盆底支持結構缺陷或者退化、損傷及功能障礙所導致，是影響中老年女性生活質量的常見疾病。POP的發病因素復雜，機體老化、氧化應激在POP的發生發展中扮演著重要角色[1]。有研究發現，機體內過多的活性氧（ROS）可對線粒體DNA（mtDNA）造成氧化損傷[2]。胰島素樣生長因子-1（IGF-1）作為一促存活因子，在多種細胞系中均表現出其抗氧化應激、抗細胞凋亡的特性[3]。PI3K/AKT信號通路被認為是最主要的促進細胞存活的一條信號通路[4]，mtDNA、IGF-1、PI3K/AKT信號通路在維持機體氧化應激/抗氧化應激平衡過程中有著重要作用，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的變化與POP的發展關系密切。本研究旨在通過檢測宮骶韌帶-子宮主韌帶復合體離體IGF-1、mtDNA及膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ的表達，為防治POP探求新的思路，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集筆者所在醫院2018年1月-2019年3月臨床POP患者50例作為研究組，同時選擇同期行子宮切除術的良性非POP患者50例作為對照組。研究組納入標準：均為已婚已育女性;經臨床確診為POP患者。對照組納入標準：均為已婚已育女性;非POP患者;子宮肌瘤、子宮內膜異常增生及宮頸病變患者。排除標準：婦科惡性腫瘤、妊娠期或哺乳期患者;長期服用避孕藥、雌激素等激素類藥物者;有既往盆腔手術史者;吸煙及濫用藥物史者。兩組患者均經手術治療，并獲得宮骶韌帶-子宮主韌帶復合體離體標本。研究組年齡（43.51±10.42）歲;POP分期：Ⅱ期11例，Ⅲ期24例，Ⅳ期15例。對照組年齡（43.79±9.89）歲;子宮肌瘤25例，子宮內膜異常增生18例，宮頸病變7例。兩組患者基線資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），有可比性。

1.2 方法

兩組均于手術治療時取宮骶韌帶-子宮主韌帶復合體離體標本，獲得非POP及POP組織，應用定量RT-PCR方法檢測兩組宮骶韌帶-子宮主韌帶復合體離體標本，檢測mtDNA、膠原蛋白Ⅰ mRNA、膠原蛋白Ⅲ mRNA水平的表達，具體步驟：RNA提取、反應體系配制、加RNA模板、RT-PCR反應、2.0%瓊脂糖凝膠制備、電泳、RT-PCR產物檢測，將電泳膠放入凝膠成像系統觀察，以內參基因為基準分析各條帶的相對密度值。

采用免疫蛋白印記法（western-blot）檢測兩組標本IGF-1、膠原蛋白Ⅰ蛋白、膠原蛋白Ⅲ蛋白的表達。主要步驟：SDS-PAGE凝膠制備及灌膠，上樣、電泳、切膠及制備硝酸纖維素膜（PVDF）、轉膜、抗原封閉、加入一抗、二抗，在避光條件下顯影，凝膠掃描成像系統分析，評估相對灰度值。

線粒體DNA（mtDNA）核酸檢測試劑盒（北京索奧生物醫藥科技有限公司），人IGF-1試劑盒（廈門慧嘉生物科技有限公司），人膠原蛋白ⅠmRNA、人膠原蛋白Ⅲ mRNA、膠原蛋白Ⅰ蛋白、膠原蛋白Ⅲ蛋白試劑盒（上海科順生物科技有限公司）;凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）。

1.3 觀察指標

比較兩組mtDNA、膠原蛋白Ⅰ mRNA、膠原蛋白Ⅲ mRNA相對密度值。比較兩組IGF-1、膠原蛋白Ⅰ蛋白、膠原蛋白Ⅲ蛋白灰度值。

1.4 統計學處理

本研究數據采用SPSS 19.0統計學軟件進行分析和處理，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，采用字2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組mtDNA、膠原蛋白Ⅰ mRNA、膠原蛋白Ⅲ mRNA相對密度值結果比較

研究組mtDNA、膠原蛋白Ⅰ mRNA、膠原蛋白Ⅲ mRNA相對密度值均低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 兩組IGF-1、膠原蛋白Ⅰ蛋白、膠原蛋白Ⅲ蛋白灰度值結果比較

研究組IGF-1、膠原蛋白Ⅰ蛋白、膠原蛋白Ⅲ蛋白灰度值均低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

3 討論

盆底支持組織主要包括韌帶、多層肌肉和筋膜，正常子宮位置的維持需要靠子宮韌帶、骨盆底肌和筋膜的共同支托。宮骶韌帶-子宮主韌帶復合體在盆底支持結構中起最主要支持力量，該韌帶復合體正常形態、位置和功能的異常，影響盆底正常功能，可最終導致POP的發生。妊娠、陰道分娩損傷、肥胖、便秘等多種因素是POP的誘因，盆底支持組織中分子生物學水平與POP的發生密切，氧化應激、炎性刺激等參與了POP的發生、發展過程[5]。

本次研究結果顯示，研究組mtDNA、膠原蛋白Ⅰ mRNA、膠原蛋白Ⅲ mRNA及IGF-1、膠原蛋白Ⅰ蛋白、膠原蛋白Ⅲ蛋白表達均低于對照組（P<0.05）。線粒體是真核細胞能量提供和儲存的場所，還在細胞凋亡中發揮重要作用。有學者發現POP患者盆底組織中存在mtDNA缺失和重排的累積，且隨著POP程度的加重而明顯累積[6]。mtDNA突變和氧化損傷的累積，促進機體的老化，引起盆底支持結構解剖及功能的異常，最終導致POP的發生。ROS主要包括超氧陰離子（O2-）、羥基（-OH）和過氧化氫（H2O2），主要來源于細胞中線粒體。隨著年齡的增長，ROS水平呈增長趨勢，而ROS清除機制卻呈退化趨勢，二者之間的平衡被打破，氧化應激導致mtDNA氧化損傷，引起突變，產生有缺陷的電子傳遞鏈（ETC）組分，導致更多ROS產生和mtDNA突變，引起呼吸鏈有關蛋白質亞單位的合成障礙，形成有缺陷的呼吸鏈，導致機體細胞ATP合成水平降低和細胞能量供給不足，致使細胞損傷[7-8]。

IGF-1的生物學活性是通過在胞外區域與IGF-1受體（IGF-1R）相結合，然后使跨膜區的IGF-1R亞基結構發生改變，引起自身磷酸化作用并激活其亞基內酪氨酸（Tyr）激酶，促使下游底物發生一系列的磷酸化，啟動細胞內的PI3K/AKT等信號通路，調整細胞的生長、增殖及凋亡等生物學效應[9-10]。PI3K/AKT信號通路與細胞生長、炎性反應及細胞凋亡有著重要聯系。PI3K是胞內磷脂酰肌醇激酶，參與細胞的能量代謝、增殖、分化及凋亡。AKT的激活，進一步激活其下游的分子信號，以直接或者間接的方式來調整細胞的生存與生長[11]。隨著年齡的不斷增長，氧自由基的產生與清除之間的平衡失調，引起細胞ROS增加，過量的ROS進入細胞核導致核內DNA損傷，引起細胞周期停滯和細胞凋亡。IGF-1可通過激活PI3K/AkT信號通路，提高細胞內SOD、GPx活性，促進細胞ROS的清除[12]。

膠原蛋白含量是決定盆底結締組織韌性強弱的重要因素，盆底結締組織中主要含Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，Ⅰ型膠原蛋白是由3條肽鏈組成的一種重要的、基本的蛋白質，Ⅰ型膠原蛋白直徑較粗，抗張能力強，起支持作用;Ⅲ型膠原蛋白直徑較細，柔韌性強。膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ水平下降，膠原合成代謝發生紊亂，引起支撐盆腔肌纖維強度降低，影響盆底結構和功能，使其韌性、彈力降低，導致POP的發生[13]。因此，POP發生的分子機制可能是，mtDNA的氧化損傷、IGF-1通過PI3K/AKT信號發揮其抗氧化應激能力，以優化機體微環境減緩POP的進展，膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ合成降低，導致盆底子宮韌帶形態、位置和功能的失常。

綜上所述，POP患者宮骶韌帶-子宮主韌帶的mtDNA、膠原蛋白Ⅰ mRNA、Ⅲ mRNA及IGF-1、膠原蛋白Ⅰ蛋白、膠原蛋白Ⅲ蛋白表達均為下調趨勢，可能參與了POP的發生。

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（收稿日期：2020-01-09） （本文編輯：桑茹南）