纖維素酶法制備海茸抗氧化多糖的研究

鄒鵬飛 杜芬 魏星

摘要 選用纖維素酶法制備海茸抗氧化多糖，并設(shè)計(jì)應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取pH、溫度和料液比為自變量，以羥自由基清除活性及超氧陰離子清除活性為響應(yīng)指標(biāo)，確定纖維素酶法制備海茸抗氧化多糖的最佳工藝為料液比1∶40（g∶mL），加酶量2%，pH 5，在50 ℃水浴中攪拌提取2 h。在該試驗(yàn)條件下，超氧陰離子抑制率為（22.28±0.97）%，羥自由基抑制率為（77.64±1.82）%，試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值相近，說(shuō)明模型擬合良好，優(yōu)化工藝準(zhǔn)確可行。

關(guān)鍵詞 纖維素酶;海茸;抗氧化活性;多糖

中圖分類號(hào) R282.77 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2020）10-0145-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.10.039

Abstract Cellulasecatalyzed hydrolysis was used to extract antioxidant polysaccharides from Durvillaea antarctica polysaccharides. Respone surface analysis methodology （RSM） was applied to optimize extraction process. Based on singlefactor experiments，pH，extraction temperature and solidliquid ratio were selected as affecting factors for BoxBehnken central composite experiment design，and hydroxyl radical scavenging activity and superoxide anion scavenging activity were taken as response indexes to determine the best process for preparation of antioxidant polysaccharides from Durvillaea antarctica by cellulase method. The process was as follows： the solidliquid ratio was 1∶40 （g∶mL），the cellulase dosage was 2%，the pH was 5，and the mixture was extracted in a water bath at 50 ℃ for 2 h.Under the optimum conditions，the superoxide free radicals scavenging capacity was （22.28±0.97）% and the hydroxyl radical scavenging capacity was （77.64±1.82）%. The experimental values were close to the predicted values，which indicated that the model fit well and the optimization process was accurate and feasible.

Key words Cellulose enzyme;Durvillaea antarctica;Antioxidant activity;Polysaccharides

南極海茸（Durvillaea antarctica）作為一種營(yíng)養(yǎng)豐富的大型褐藻，主要分布于南極洲附近及智利南部。極端的生存環(huán)境使其富含多種生物活性物質(zhì)，其中南極海茸富含褐藻膠、巖藻糖、葡聚糖等多種具有生物活性的多糖[1]，研究表明南極海茸多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性、抗凝血活性、降血糖及抗氧化活性等作用[2-5]。

多糖的抗氧化活性的作用機(jī)理目前研究尚不明確，但可以肯定的是多糖的抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，因此改變多糖的組成，使其暴露更多的活性基團(tuán)，從而可以提高多糖的抗氧化活性[6-9]。目前多糖降解的方法主要有物理法、化學(xué)法、酶降解法等，其中酶法降解反應(yīng)條件溫和，易于操作[10-13]。酶按作用機(jī)制分為專一性酶和非專一性酶，其中非專一性酶價(jià)格低廉，商業(yè)化程度更高。已有文獻(xiàn)報(bào)道纖維素酶可以對(duì)多種多糖有明顯的降解作用，其反應(yīng)過(guò)程受酶添加量、pH、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度及料液比等因素的影響[14-15]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)南極海茸的研究較少，尤其是活性多糖方面就更為少見(jiàn)。在國(guó)內(nèi)已有研究中，對(duì)南極海茸的研究主要偏重于飲食方面[16]，在南極海茸多糖方面主要集中在提取純化[17]、光譜結(jié)構(gòu)分析及單糖組成[18]等，南極海茸多糖的生物活性方面研究較少。筆者將纖維素酶應(yīng)用于制備海茸抗氧化多糖，并對(duì)南極海茸抗氧化多糖的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，為南極海茸多糖的研究及其在食品行業(yè)、化妝品行業(yè)等多領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試材

海茸粗多糖，由青島海洋生物醫(yī)藥研究院功能制品平臺(tái)提供;羥自由基測(cè)試試劑盒、超氧陰離子自由基測(cè)試試劑盒，南京建成生物工程研究所;纖維素酶，和氏璧生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器

紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，UNICO公司;SY21-NI4V恒溫水浴鍋，北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司;冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 海茸多糖抗氧化活性測(cè)定。

1.3.1.1 超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定[19]。清除超氧陰離子自由基的能力采用鄰苯三酚自氧化法，鄰苯三酚在堿性條件下會(huì)發(fā)生自氧化，生成有色中間產(chǎn)物和超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基對(duì)自氧化有催化作用。選擇超氧陰離子自由基測(cè)試試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，以蒸餾水代替樣品做空白組，按下式計(jì)算清除率：

超氧陰離子清除率=A空白-A樣品A空白×100%

式中，A樣品、A空白分別為樣品和空白在520 nm 處的吸光度。

1.3.1.2 羥自由基清除率的檢測(cè)[20]。Fenton反應(yīng)是常見(jiàn)的產(chǎn)生羥自由基的化學(xué)反應(yīng)，H2O2的量和Fenton反應(yīng)生成的羥自由基的量成正比，當(dāng)給予電子受體后，通過(guò)顯色反應(yīng)即可確定羥自由基清除率。羥自由基清除能力的測(cè)定是通過(guò)羥自由基測(cè)試試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，在 520 nm 處測(cè)定吸收度?？瞻捉M以蒸餾水代替供試樣品，并按下式計(jì)算清除率：

羥自由基清除率=A樣品-A空白A對(duì)照-A空白

式中，A樣品、A空白、A對(duì)照分別為樣品、空白和對(duì)照的吸光度。

1.3.2 酶解條件的選擇。纖維素酶法制備海茸抗氧化多糖其中以纖維素酶添加量、pH、溫度、時(shí)間及料液比為單因素，分別以羥自由基清除活性及超氧陰離子自由基清除活性為考察指標(biāo)確定酶解條件。

1.3.3 酶解條件的響應(yīng)面優(yōu)化。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇pH、溫度、料液比3個(gè)因素為自變量，以羥自由基清除活性、超氧陰離子清除活性為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.05 軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)重復(fù) 3 次進(jìn)行，采用 Design-Expert 8.05 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和分析，采用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 海茸多糖的羥自由基清除活力的單因素試驗(yàn)

以羥自由基清除活性為指標(biāo)，根據(jù)纖維素酶法制備海茸抗氧化多糖單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，該酶在pH 4.5的酶解產(chǎn)物顯示出最優(yōu)的羥自由基清除活性;該酶在40～60 ℃均具有較高的酶活力，且在45 ℃達(dá)到最高;反應(yīng)時(shí)間不同，海茸多糖的聚合度不同，其羥自由基清除活性不同，反應(yīng)時(shí)間2 h時(shí)，酶解產(chǎn)物顯示出較高的羥自由基活性，綜合考慮時(shí)間成本，選擇2 h進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面分析;當(dāng)料液比為1∶40時(shí)酶解產(chǎn)物羥自由基活性達(dá)到最大。當(dāng)酶添加量低于3%時(shí)，隨著酶濃度的增加酶解產(chǎn)物羥自由基活性隨之增加，且當(dāng)酶添加量高于1.5%增速變緩。

2.2 海茸多糖的超氧陰離子自由基清除活力的單因素試驗(yàn)?

以超氧陰離子清除活性為指標(biāo)，根據(jù)纖維素酶法制備海茸抗氧化多糖單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，pH 4～5時(shí)酶解產(chǎn)物顯示較高的超氧陰離子清除活性;酶解產(chǎn)物在溫度45 ℃時(shí)超氧陰離子清除活性略高于其他溫度的酶解產(chǎn)物，但溫度優(yōu)勢(shì)不明顯;酶解產(chǎn)物在2 h及料液比1∶40時(shí)，超氧陰離子清除活性達(dá)到最大;酶解產(chǎn)物的超氧陰離子清除活性與酶添加量整體呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。

2.3 響應(yīng)面法對(duì)纖維素酶解條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考慮酶解產(chǎn)物的羥自由清除活性及超氧陰離子清除活性，采用Design-Expert 8.05進(jìn)行3因素5水平設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，固定酶解時(shí)間2 h，纖維素酶添加量2%，以pH（A）、溫度（B）和料液比（C）為自變量，以超氧陰離子抑制率及羥自由基抑制率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面法分析纖維素酶解條件優(yōu)化，結(jié)果如表1所示。

對(duì)超氧陰離子清除活性與溫度、pH和料液比進(jìn)行方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該數(shù)學(xué)模型F值為4.42（P=0.031 4<0.05），達(dá)到了顯著水平，說(shuō)明該方程的試驗(yàn)點(diǎn)與結(jié)果相吻合;而失擬性檢驗(yàn)F值為2.91（P=0.164 2>0.05），差異不顯著，表明方程沒(méi)有失擬因素，回歸方程的擬合較好，模型能夠反映真實(shí)的情況。采用Design-Expert 8.05統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行回歸優(yōu)化得到模型為：

超氧陰離子活性=22.95-0.67A-0.37B+0.62C+1.33AB-1.81AC+0.66BC-1.75A2-0.92B2-2.52C2。

方差分析表明，3個(gè)因素對(duì)酶解產(chǎn)物超氧陰離子清除活性的影響從大到小依次為pH、料液比、溫度，綜上所述該回歸方程可以用于描述酶解產(chǎn)物超氧陰離子清除活性與酶解因素的關(guān)系。

對(duì)羥自由基清除活性與溫度、pH和料液比進(jìn)行方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該數(shù)學(xué)模型F值為6.55（P=0.010 8<0.05），達(dá)到了極顯著水平，說(shuō)明該方程的試驗(yàn)點(diǎn)與結(jié)果相吻合;而失擬性檢驗(yàn)F值為3.68（P=0.120 0>0.05），差異不顯著，表明方程沒(méi)有失擬因素，回歸方程的擬合較好，模型能夠反映真實(shí)的情況。采用Design-Expert 8.05統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行回歸優(yōu)化得到模型為：

羥自由基清除活性=87.80-4.01A+3.06B+1.81C-2.65AB-2.80AC+4.54BC-8.06A2-1.68B2-480C2。

方差分析表明，3個(gè)因素對(duì)酶解產(chǎn)物羥自由基清除活性的影響從大到小依次為pH、溫度、料液比，綜上所述該回歸方程可以用于描述羥自由基清除活性與酶解因素的關(guān)系。

2.4 最佳酶解條件的確定與驗(yàn)證?

綜合考慮超氧陰離子和羥自由基清除活性最大值進(jìn)行條件優(yōu)選，得出最優(yōu)方法為料液比1∶40，加酶量2%，pH 5，在50 ℃水浴中攪拌提取2 h，得到活性最高的多糖提取物，其抗超氧陰離子抑制率為2272%，羥自由基抑制率為78.71%。采用優(yōu)選出來(lái)的最佳條件進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，超氧陰離子抑制率為22.28%±0.97%，羥自由基抑制率為77.64%±1.82%，得到的實(shí)際試驗(yàn)與理論值相差較小，因此Box-Behnken Design-響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)可行，模型設(shè)計(jì)合理。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.05進(jìn)行3因素5水平響應(yīng)面分析，得到纖維素酶解海茸多糖的回歸方程模型，方程擬合較好。在所選的各因素水平范圍內(nèi)，pH對(duì)酶解工藝的影響最大，溫度及料液比對(duì)酶解產(chǎn)物羥自由基清除活性、超氧陰離子清除活性的影響順序不同，綜合考慮2種離子的清除活性得到最優(yōu)條件為料液比1∶40、加酶量2%、pH 5，在50 ℃水浴中攪拌提取2 h，以該條件制備的海茸多糖具有較好的抗氧化活性，為其進(jìn)一步在食品領(lǐng)域、化妝品領(lǐng)域提供更好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)

[1] 李建杰，胡婷，李全才，等.南極海茸多糖咀嚼片的制備及含量測(cè)定[J].中國(guó)海洋藥物，2019，38（1）：56-62.

[2] OHISHI H，HATTORI T，TANI H，et al.Seaweedderived immunostimulant and anti inflammotory agent：WO 2008/059819 A1[P].2008-05-22.

[3] MATSUHIRO B，ZUGA E，JASHES M，et al.Sulfated polysaccharides from Durvillaea antarctica[J].Hydrobiologia，1996，321（1）：77-81.

[4] SHARIFUDDIN Y，CHIN Y X，LIM P E，et al.Potential bioactive compounds from seaweed for，diabetes management[J].Marine drugs，2015，13（8）：5447-5491.

[5] HENTATI F，DELATTRE C，URSU A V，et al.Structural characterization and antioxidant activity of watersoluble polysaccharides from the Tunisian brown seaweed Cystoseira compressa[J].Carbohydrate polymers，2018，198：589-600.

[6] 冉靚，楊小生，王伯初，等.抗氧化多糖的研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17（4）：494-496.

[7] 馬軍，侯萍，陳燕，等.幾種海藻多糖抗氧化活性及體外抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用的研究[J].南方水產(chǎn)科學(xué)，2017，13（6）：97-104.

[8] CHEN S G，HU Y Q，YE X Q，et al.Sequence determination and anticoagulant and antithrombotic activities of a novel sulfated fucan isolated from the sea cucumber Isostichopus badionotus[J].Biochimica et biophysica acta，2012，1820（7）：989-1000.

[9] YU L，XUE C H，CHANG Y G，et al.Structure and rheological characteristics of fucoidan from sea cucumber Apostichopus japonicus[J].Food chemistry，2015，180：71-76.

[10] 李萍，李衛(wèi)燕，曹蔚.酶解技術(shù)在多糖結(jié)構(gòu)和活性研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志，2015，30（4）：433-436.

[11] MENG J，LV Z Y，QIAO X H，et al.The decay of Redoxstress Response Capacity is a substantive characteristic of aging：Revising the redox theory of aging[J].Redox biology，2017，11：365-374.

[12] LAHRSEN E，LIEWERT I，ALBAN S.Gradual degradation of fucoidan from Fucus vesiculosus and its effect on structure，antioxidant and antiproliferative activities[J].Carbohydrate polymers，2018，192：208-216.

[13] 李冬霞，夏文水.脂肪酶中具有殼聚糖酶活力組分的作用模式及鑒定[J].食品工業(yè)科技，2008，29（8）：115-116，120.

[14] 孫麗娜，范英兵，胡冬慧，等.響應(yīng)面優(yōu)化纖維素酶提取藍(lán)莓多糖工藝研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2017，38（23）：57-60.

[15] 王鵬，郭麗，孔璐，等.堿浸提和纖維素酶輔助提取藍(lán)莓多糖及其抗氧化能力的對(duì)比研究[J].糧食與油脂，2017，30（4）：94-97.

[16] 叢大鵬.南極海茸（Durvillaea antarctica）多糖提取、衍生物制備及免疫活性研究[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2015.

[17] 蔡如繁.南極海茸營(yíng)養(yǎng)成分及多糖提取、分離純化、抗氧化性和結(jié)構(gòu)特性研究[D].杭州：浙江工業(yè)大學(xué)，2014.

[18] 何晉浙，蔡如繁，孫培龍.南極海茸多糖結(jié)構(gòu)及其單糖組分的分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40（3）：196-200.

[19] 范三紅，任嘉興，張錦華，等.響應(yīng)面優(yōu)化羊肚菌多糖提取工藝及抗氧化性[J].食品工業(yè)科技，2019，40（6）：179-185，192.

[20] 黃上峰，陸飛燕，黃元河，等.三七多糖抗氧化活性研究[J].微量元素與健康研究，2018，35（1）：30-32.