藏藥西伯利亞蓼降尿酸活性部位篩選及HPLC分析

朱繼孝 王陸 鐘國躍

摘要 [目的]研究藏藥西伯利亞蓼不同部位降尿酸活性，并采用HPLC法進行分析檢測。[方法]以氧嗪酸鉀鹽誘導建立小鼠急性高尿酸血癥模型，連續灌胃給予西伯利亞蓼水部位（2.0、4.0 g/kg）、30%乙醇部位（2.0、4.0 g/kg）、50%乙醇部位（2.0、4.0 g/kg）、90%乙醇部位（2.0、4.0 g/kg）及別嘌呤醇（AP，0.01 g/kg）7 d，探討西伯利亞蓼不同部位對急性高尿酸血癥血尿酸（UA）、肝臟黃嘌呤氧化酶（XOD）活性及尿酸轉運體（mURAT1、mGLUT9 和mOAT1）mRNA表達的影響，并對不同部位進行HPLC分析。[結果]與模型組相比，AP以及30%、50%、90%乙醇部位顯著降低高尿酸血癥的血尿清水平;50%、90%乙醇部位既可以抑制黃嘌呤氧化酶活性又可以調控尿酸轉運體的表達;30%乙醇部位僅對尿酸轉運體具有調控作用;不同部位HPLC圖顯示除了30%、50%乙醇部位化學成分有重疊，西伯利亞蓼不同部位化學成分差別較大。[結論]30%、50%、90%乙醇部位是西伯利亞蓼的降尿酸的活性部位，其作用機制為抑制XOD活性和調控尿酸轉運體的表達;西伯利亞蓼不同部位HPLC圖有一定的差別，為探討西伯利亞蓼不同部位降尿酸藥效物質基礎提供一定的依據。

關鍵詞 西伯利亞蓼;降尿酸;活性部位;篩選;HPLC;作用機制

中圖分類號 R282.71 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2020）10-0141-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.10.038

Abstract [Objective] The research aimed to study the lowering uric acid activity of different parts of Polygonum sibiricum， and to analyze and detect it by HPLC.[Method]Water fractions （2.0， 4.0 g/kg）， 30% ethanol fractions （2.0， 4.0 g/kg）， 50% ethanol fractions （2.0， 4.0 g/kg）， 90% ethanol fractions （2.0， 4.0 g/kg） and allopurinol （AP， 0.01 g/kg） were administered to hyperuricemia mice induced by potassium oxonate for seven days. The level of uric acid （UA） and xanthine oxidase （XOD） on different fractions were analyzed and the mRNA express of renal protein transporter （mOAT1， mURAT1 and mGLUT9） were also studied. The different parts of P. sibiricum were analyzed by HPLC. [Result]Compared with the model group， AP and 30%， 50%， 90% ethanol fractions of P. sibiricum obviously lowered the serum UA levels; 50% and 90% ethanol fractions not only inhibited the activity of XOD， but also regulated the expression of uric acid transporter; 30% ethanol fractions only regulated the uric acid transporter.The HPLC chart of different parts showed that the chemical constituents of different fractions were obvious distinctions except for the overlap of 30% and 50% ethanol fractions. [Conclusion]30%， 50% and 90% ethanol fractions are effective fractions of P. sibiricum and its mechanism is to inhibit XOD activity and regulate the expression of uric acid transporters. The HPLC images of different parts have certain differences， which provide a basis for exploring the physiochemical discussion for the reduction of uric acid.

Key words Polygonum sibiricum;Lowering uric acid;Active site;Screening;HPLC;Mechanism of action

??

在普通人群中，痛風患病率在全球范圍內為0.1%～10.0%，其中老年人、男性的發病率偏高[1]。現有治療痛風藥物主要有別嘌呤醇、苯溴馬隆等[2]，但由于副作用較多，患者難以長期服用和耐受[3]，遠遠不能滿足臨床需求。因此，亟需開發高效低毒、作用機制新穎、價格相對低廉的抗痛風藥物。

基于“相生相克”的中醫理論，國內外學者考慮從傳統中藥，或是民族藥中尋找有效的抗痛風藥物。中藥包括民族藥治療痛風、高尿酸血癥備受關注，取得了一些進展[4]。目前國內外學者已對多種草藥單方或復方提取物進行了抗痛風活性研究，如短管兔耳草[5]、三妙丸[6]、丹溪痛風方[7]、梔子[8]、車前草[9]、黃柏[10]、唐古特大黃[11]、茶樹根[12]、荬麻藤[13]、貓須草[14]等，其作用機制涉及到降尿酸的生成和促進尿酸排泄2種作用機制。由此可見，從中藥甚至民族藥中尋找抗痛風藥物具有潛在的研究前景。

藏藥西伯利亞蓼（Polygonum sibiricum）是蓼科（Polygonaceae）蓼屬植物多年生草本，主要分布于蒙古、俄羅斯、西藏、東北、華北等地，具有疏風清熱、利水消腫的功效，目前鮮見西伯利亞蓼的藥理研究。王曉云等[15]研究發現西伯利亞蓼 70%乙醇總提取物具有降尿酸作用，但其有效部位尚不清楚。基于此，該研究采用高尿酸血癥模型研究西伯利亞蓼不同部位降尿酸作用，并對不同部位進行高效液相分析比較，為西伯利亞蓼的開發及利用提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗動物。

110只昆明種小鼠，雄性，SPF級，從湖南斯萊克景達實驗動物有限公司購買，動物許可證號：SCXK（湘）2013-0004，整個試驗保持在室溫23～25 ℃。

1.1.2 試驗儀器。

CP214型電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司;傅日PCR儀，杭州博日科技有限公司;電熱恒溫箱，上海博迅實業有限公司;UV2100 紫外可見分光光度儀，北京瑞利分析儀器公司;Biorad凝膠成像儀，美國伯樂有限公司;CP214型電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司;旋轉蒸發儀，瑞士布奇有限公司;RORMA-86C 型超低溫冰箱，美國Thermo公司。

1.1.3 藥品及試劑。

氧嗪酸鉀鹽（批號STBD5759V）和別嘌呤醇（批號081M1112V）由Sigma-Aldrich生產;尿酸測定試劑盒（20150428）、黃嘌呤氧化酶測試盒（20151210）、考馬斯亮藍測試盒（20151208）由南京建成生物工程研究所生產;總RNA 提取試劑盒（批號N3205）由天根生化科技（北京）有限公司提供;反轉錄試劑盒（批號0000123564）由美國Promega 公司提供;尿酸轉運體引物購買于天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.4 試材。

藏藥西伯利亞蓼于2013年10月采自西藏昌都，經江西中醫藥大學鐘國躍研究員鑒定為Polygonum sibiricum Laxm的干燥全草。藏藥西伯利亞蓼藥材用70%乙醇提取，過D101大孔樹脂不同梯度洗脫得到4個部位：水部位（FW，450.0 g）、30%乙醇部位（F30%，30.0 g）、50%乙醇部位（F50%，45.0 g）、90%乙醇部位（F90%，12.0 g），各部位的提取率分別為15.0%、1.0%、1.5%、0.4%[16]。

1.2 試驗方法

1.2.1 小鼠分組、造模及給藥。

將110只小鼠隨機分為11組，每組10只，分別為空白組（N）、模型組（急性高尿酸血癥組，M）、陽性對照組（別嘌呤醇組，AP）、水部位低劑量組（FWL）、水部位高劑量組（FWH）、30%乙醇部位低劑量組（FL30%）、30%乙醇部位高劑量組（FH30%）、50%乙醇部位低劑量組（FL50%）、50%乙醇部位高劑量組（FH50%）、90%乙醇部位低劑量組（FL90%）、90%乙醇部位高劑量組（FH90%）。趙雪梅等[14]研究西伯利亞蓼總提物降尿酸發現，西伯利亞蓼低、中、高劑量組均可顯著降尿酸作用，因此該研究西伯利亞蓼給藥劑量仍按生藥量計算，不同部位低、高劑量組給藥劑量分別為2.0、4.0 g/kg，別嘌呤醇給藥劑量為0.01 g/kg，每天08：00灌胃給予模型組及各給藥組氧嗪酸鉀鹽 250 mg/kg，1 h后給予藥物，連續給藥7 d，每天一次，空白組和模型組分別灌入相應體積的生理鹽水，給藥劑量均為15 mL/kg，第7天給藥1.0 h后按照文獻[5]取血和分離肝臟、腎臟。

1.2.2 血清尿酸水平（UA）和尿素氮（BUN）測定。按照尿酸和尿素氮試劑盒說明方法測定。

1.2.3 肝臟黃嘌呤氧化酶（XOD）的活性測定。將小鼠肝臟組織稱重，按照文獻方法[8，14]測定蛋白含量及XOD活性。

1.2.4 腎臟尿酸轉運體（mURAT1、mGLUT9和mOAT1）mRNA 的表達。

參考文獻[5，15]測定腎臟尿酸轉運體 URAT1、OAT1和GLUT9的mRNA表達：取腎臟皮質組織0.1 g，按照試劑盒方法，TRIzol 法提取總 RNA。加入引物序列分別為 URAT1（5′-GCTACCAGAATCG-GCACGCT-3′，5′-CACCGG GAAGTCCACAATCC-3′）、GLUT9（5′-ACTCCTACTGCTTCCTCGTCTT-3′，5′-GCT-GATTTCTGCATGGGTTC-3′）、OAT1（5′-ACGGGAAA-CAAGAAGAGGG-3′，5′- AAGAGAGGTATGGAGGGGTAG-3′）、GAPDH（5′-TGAGGCCGGTGCTGAGTAT GT-3′，5′-CAGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′），按照文獻[14]的擴增條件進行擴增。采用瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像儀成像，計算光密度。以 GAP-DH 作為參照計算得到待測基因的相對表達值。

1.2.5 不同部位高效液相色譜分析。

1.2.5.1 西伯利亞蓼供試品溶液制備。準確稱取西伯利亞蓼不同部位FW、F30%、F50%、F90%各20 mg，加入甲醇和水不同比例各2.0 mL超聲溶解，得到10 mg/mL的供試品溶液。

1.2.5.2 色譜條件。色譜柱為Intersil ODS-SP（4.6 mm×150 mm，5 μm）;甲醇（A）和水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～6 min，A 10%～10%;6～10 min，A 10%～30%;10～30 min，A 30%～60%;30～50 min，A 60%～90%;50～55 min，A 90%～100%;55～60 min，A 100%～10%;60～65 min，A 10%～10%），柱溫為30 ℃，流速1.0 mL/min，運行時間為65 min。

1.3 統計學處理

統計學處理采用 SPSS 18.0 軟件，數據結果用±S表示。采用單因素方差分析，P<0.05 表明具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 藏藥西伯利亞蓼不同部位對高尿酸血癥小鼠UA、XOD、BUN活性的影響

由表1可知，與空白組（N組）相比，模型組（M組）小鼠UA、XOD和BUN顯著升高（P<0.01，P<0.05）;與M組相比，AP組、FL30%、FH30%、FH50%、FH90%組在一定程度上均可降低高尿酸血癥的血尿清水平（P<0.01，P<0.05）。XOD是體內嘌呤類物質代謝成尿酸最后兩步的關鍵酶，通過不同部位對XOD活性影響表明，除了FL30%、FH30%以外，其他部位低、高劑量組均對肝臟XOD具有一定的抑制作用（P<0.01，P<0.05）。BUN是檢驗腎功能的重要指標，可以反映腎小球濾過和腎小管重吸收的功能，FWL、FWH、FL30%、FH30%、FH90%均可降低高尿酸血癥小鼠尿素氮的水平。

2.2 藏藥西伯利亞蓼不同部位對腎臟尿酸轉運體（mOAT1、mURAT1和mGLUT9）mRNA的表達

由圖1可知，與模型組（M組）相比，AP組、FWL、FL30%、FL90%、FH90%對小鼠腎臟URAT1 mRNA的表達具有顯著下調作用（P<0.01，P<0.05），其中FWL可下調URAT1 mRNA至正常水平;西伯利亞蓼不同部位低、高劑量組均可顯著下調GLUT9 mRNA的表達（P<0.01，P<0.05），其中AP、FH90%可下調URAT1 mRNA至正常水平;僅AP、FWL、FH30%、FL50%、FH50%可顯著上調OAT1 mRNA的表達，且AP、FWL、FL50%、FH50%均可上調OAT1 mRNA至正常水平及以上（P<0.01）。

2.3 藏藥西伯利亞蓼不同部位HPLC?

由圖2可知，除了F30%和F50%化學成分有部分重疊，西伯利亞蓼不同部位化學成分差別較大;王洪玲等[16]研究發現西伯利亞蓼30%、50%乙醇部位都含有蘆丁和番石榴苷，此外50%乙醇部位還含有木犀草素和槲皮素。

3 結論與討論

“黃水病”和“惡性腹水”是藏區多發疾病，也是藏醫學臨床具有治療優勢的病種之一。基于本草考證和實地調查，發現“曲瑪孜”類藥材為常用治療這類疾病的藏藥材。西伯利亞蓼（Polygonum sibiricum）為藏藥“曲瑪孜”基原品種之一，目前鮮見相關的化學和藥理學研究。王曉云等[15]研究發現西伯利亞蓼70%乙醇部位具有降尿酸作用，但是其有效部位和藥效物質基礎尚不清楚。基于此，該研究對西伯利亞蓼大孔樹脂洗脫的4個部位進行降尿酸研究，發現30%、50%、90%乙醇部位具有降尿酸作用;目前研究表明XOD常用于痛風、殺菌及自由基分子損傷等模型研究，西伯利亞蓼水部位（FW）未顯示明顯的抗尿酸作用，但是對XOD具有一定的抑制作用，提示FW可能具有治療其他疾病的可能;30%乙醇部位具有降尿酸作用，但是對XOD沒有抑制作用，推測30%乙醇部位可能存在其他降尿酸作用機制。

尿酸轉運體蛋白是近年來國外學者比較關注的熱點[17]，其中URAT1、GLUT9 和OAT1分別負責尿酸的重吸收、分泌和轉運作用。該研究發現30%乙醇部位可以顯著下調URAT1和GLUT9、上調OAT1 mRNA的表達;50%乙醇部位可顯著下調GLUT9和上調OAT1 mRNA的表達;90%乙醇部位可顯著下調URAT1和上調OAT1 mRNA的表達，以上研究進一步表明西伯利亞蓼降尿酸存在不同途徑。

通過文獻查閱，發現黃酮類成分（如蘆丁、木犀草素、桑色素等）具有抗痛風活性[18-21]，該研究發現30%和50%乙醇部位均含有黃酮類化合物，推測黃酮化合物可能是這2個部位抗痛風的活性成分。尿素氮是檢驗腎功能的重要指標，30%、90%乙醇部位均可降低高尿酸血癥小鼠尿素氮的水平，提示西伯利亞蓼具有降尿酸的同時也具有改善腎功能的功效。

參考文獻

[1] KUO C F，GRAINGE M J，ZHANG W Y，et al.Global epidemiology of gout：Prevalence，incidence and risk factors[J].Nat Rev Rheumatol，2015，11：649-662.

[2] 承良鳳，陸進明.痛風藥物治療新進展[J].中國臨床藥理學與治療學，2015，20（9）：1066-1071.

[3] YUE C S，HUANG W，ALTON M，et al.Population pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of pegloticase in subject with hyperuricemia and treatmentfailure gout[J].Clin Pharmacol，2008，48（6）：708-718.

[4] 張磊，劉維，吳沅皞，等.中醫藥治療痛風近況[J].世界中醫藥，2015，10（10）：1631-1634.

[5] 曾金祥，許兵兵，李敏，等.藏藥短管兔耳草醇提物降低急性高尿酸血癥小鼠血尿酸水平及機制研究[J].中國新藥雜志，2015，24（21）：2489-2493.

[6] WANG X，WANG C P，HU Q H，et al.The dual actions of Sanmiao wan as a hypouricemic agent：Downregulation of hepatic XOD and renal mURAT1 in hyperuricemic mice[J].J Ethnopharmacol，2010，128：107-115.

[7] 劉丹，施仁潮.丹溪痛風方治療痛風性疾病的研究進展[J].中醫藥學報，2013，41（4）：125-127.

[8] 朱繼孝，朱玉野，羅光明，等.梔子提取物降低小鼠急性高尿酸血癥血尿酸水平及機理研究[J].安徽農業科學，2011，39（36）：22317-22318，22324.

[9] 曾金祥，魏娟，畢瑩，等.車前子醇提物降低急性高尿酸血癥小鼠血尿酸水平及機制研究[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（9）：173-177.

[10] 楊澄，朱繼孝，王穎，等.鹽制對黃柏抗痛風作用的影響[J].中國中藥雜志，2005，30（2）：145-148.

[11] 楊小花，吳萍.唐古特大黃對痛風性腎病模型大鼠 eNOS、ET、6-Keto-PGF1α 表達的影響[J].世界科學技術-中醫藥現代化，2015，17（4）：865-870.

[12] 余雄英，周軍，曹樹穩，等.茶樹根抗痛風作用的實驗研究[J].江西中醫藥，2014，45（10）：36-38.

[13] 楊琴芳，袁紅宇，錢雅璐.買麻藤提取物抑制黃嘌呤氧化酶活性實驗研究[J].江蘇中醫藥，2009，41（12）：77-78.

[14] 趙雪梅，譚昌恒，張輝，等.貓須草提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用[J].中藥藥理與臨床，2009，25（3）：45-47.

[15] 王曉云，王洪玲，張亞梅，等.西伯利亞蓼醇提物對高尿酸血癥小鼠尿酸生成和排泄的影響研究[J].中國新藥與臨床藥理，2015，26（5）：626-631.

[16] 王洪玲，梁文娟，朱繼孝，等.藏族藥西伯利亞蓼化學成分的分離鑒定[J].中國實驗方劑學雜志，2017，23（7）：60-63.

[17] 堯貴林，王海勇，陸濤.促尿酸排泄藥物研究進展[J].中國醫科大學學報，2016，47（4）：491-496.

[18] 王亞杰，張國文.桑色素對黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用[J].食品科學，2014，35（13）：143-146.

[19] SONG H P，ZHANG H，FU Y，et al.Screening for selective inhibitors of xanthine oxidase from Flos Chrysanthemum using ultrafiltration LC-MS combined with enzyme channel blocking[J].J Chromatogr B，2014，961：56-61.

[20] ZHU J X，WANG Y，KONG L D，et al.Effects of Biota orientalis extract and its flavonoid constituents，quercetin and rutin on serum uric levels in oxonateinduced mice and xanthine dehydrogenase and xanthine oxidase activities in mouse liver[J].J Ethnopharmacol，2004，93（1）：133-140.

[21] HONG S S，SEO K，LIN S C，et al.Interaction characteristics of flavonoids with human organic anion transporter 1（hOAT1）and 3（hOAT3）[J].Pharmacol Res，2007，56（6）：468-473.