miR-222-3p靶向SOCS5促進宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲

薄曉莉 哈麗亞·哈力木別克 潘 靜 張清華 付曉雯 王建軍

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，其發生率和病死率常年居高不下[1，2]。盡管早期宮頸癌的篩查和治療有助于挽救60%～90%患者的生命，但多數患者仍在晚期發現，導致其預后較差[3]。因此，闡明宮頸癌發生、發展的分子機制，有助于制定更好的治療策略。

微小RNA(microRNAs, miRNAs)是一類存在于生物體的非編碼RNA分子，其長度約21～25個核苷酸[4]。miRNAs通過結合mRNAs的3′端非翻譯區，調節蛋白表達，進而在多種生理和病理過程中發揮作用[5]。近期的一項研究顯示，miR-222在宮頸癌中顯著高表達[6]。miR-222是一種前體微小RNA，其成熟體miR-222-3p是在miR-222的3′端臂加工而來。然而，miR-222-3p在宮頸癌中的作用尚未見報道。本研究旨在明確miR-222-3p在宮頸癌細胞惡性生物學行為中的具體作用。

材料與方法

1.研究對象：5例宮頸癌患者來自于筆者醫院婦產科，5例健康人來自筆者醫院體檢中心，其年齡、體重等指標均相匹配。受試對象均被告知本研究的目的，并簽署知情同意書。涉及的操作遵照筆者醫院醫學倫理學委員會的相關規定。

2.細胞系：正常宮頸上皮永生化細胞系End1/E6E7、宮頸癌細胞系SiHa、人胚腎細胞HEK-293T均購自美國ATCC公司，保存于實驗室。

3.試劑與儀器：胎牛血清FBS、DMEM培養基和高糖DMEM培養基(美國Gibco公司)，miRNeasy Serum/Plasma試劑盒和miRNeasy Mini試劑盒(德國Qiagen公司)，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(日本TaKaRa公司)，引物、miR-222-3p mimics、SOCS5過表達質粒、載有野生型SOCS5和突變型SOCS5的載體pGL3(中國生工公司)，Lipofectamine 3000(美國Invitrogen公司)，CCK-8試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、小鼠抗GAPDH單克隆抗體和辣根過氧化物酶耦合二抗(中國碧云天公司)，Transwell小室(美國BD Biosciences公司)，PVDF膜(美國Millipore公司)，兔抗SOCS5多克隆抗體(美國Abcam公司)，熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Promega公司)，倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，實時定量PCR儀、電泳儀、轉膜儀、化學發光儀和酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

4.細胞培養：End1/E6E7細胞和SiHa細胞培養于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養基，HEK-293T細胞培養于10%胎牛血清的DMEM培養基，隔天換液，在5% CO2、37℃條件下進行培養，當細胞密度達到80%時進行傳代。

5.實時熒光定量PCR：血清微小RNA的提取用miRNeasy Serum/Plasma試劑盒，細胞微小RNA用miRNeasy Mini試劑盒提取，經反轉錄后獲得cDNA后，用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進行實時熒光定量，程序設定為95℃10min，然后40個循環為95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s。U6作為微小RNA內參，采用2-ΔΔCT方法計算相對表達。Hsa-miR-222-3p：正向引物5′-GGGGAGCTACATCTGGCT-3′，反向引物5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′。U6：正向引物5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，反向引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

6.細胞活力測定：SiHa細胞接種于96孔板，每孔細胞數約6000個，將miR-222-3p mimics(1μl)、Notch1過表達質粒(1.2μl)，利用Lipofectamine 3000轉染至SiHa細胞培養48h，然后更換培養基，每孔100μl培養基加入10μl CCK-8反應液，培養2h后于酶標儀測定，波長設定450nm。

7.細胞劃痕實驗：將轉染了miR-222-3p mimics、pcDNA3.1-SOCS5的SiHa細胞接種于6孔板，每孔細胞數約為密度約為2×105個，過夜培養后，用移液管尖端進行劃痕，用無菌PBS輕輕洗去劃下的細胞，加入無血清培養基常規培養，24h后進行拍照。

8.Transwell實驗：將轉染了miR-222-3p mimics、pcDNA3.1-SOCS5的SiHa細胞在無血清的培養基重懸，Transwell小室的上室接種約2×105個細胞，Transwell小室的下室倒入含血清的培養基。在細胞孵箱培養24h后，用甲醇固定下室細胞，并用0.5%結晶紫染色20min，然后在倒置顯微鏡下觀察、拍照并計數。

9.熒光素酶報告基因實驗：熒光素酶報告基因實驗在HEK-293T細胞中進行。HEK-293T細胞接種于96孔板，約6000個/孔，將載有野生型SOCS5的pGL3(1μl)與miR-222-3p mimics(1μl)、載有突變型SOCS5的pGL3(1μl)與miR-222-3p mimics(1μl)、載有野生型SOCS5的pGL3(1μl)與mimics NC(1μl)、載有突變型SOCS5的pGL3(1μl)與mimics NC(1μl)分別利用Lipofectamine 3000共轉染至HEK-293T細胞內，48h后用Bio-GloTMLuciferase Assay System檢測，分析數值。

10.蛋白免疫印跡：收集SiHa細胞，用RIPA裂解，BCA法蛋白濃度定量；蛋白樣品用SDS-PAGE凝膠分離，然后轉至PVDF膜；PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉2h；抗SOCS5和GAPDH一抗在4℃過夜孵育；TBST洗膜后，用辣根過氧化物酶耦合的二抗在室溫孵育PVDF膜2h；ChemDocTMXRS+ System儀器檢測目的條帶，并用Image Lab軟件進行灰度分析。

結 果

1.miR-222-3p在宮頸癌上調表達：分別取健康人血清和宮頸癌患者血清，檢測miR-222-3p的表達水平，qRT-PCR的結果顯示，患者血清的miR-222-3p顯著增多(圖1A，P=0.008)。此外，宮頸癌細胞系SiHa的miR-222-3p表達水平也顯著高于正常宮頸上皮永生化細胞系End1/E6E7(P<0.01,圖1B)。

圖1 miR-222-3p在宮頸癌上調表達A.miR-222-3p在宮頸癌患者血清和健康對照組血清中的表達；B.miR-222-3p在正常宮頸上皮永生化細胞系End1/E6E7和宮頸癌細胞系SiHa中的表達

2.miR-222-3p促進宮頸癌細胞惡性表型：將miR-222-3p mimics轉染至SiHa細胞，其增殖能力高于轉染mimics NC的SiHa細胞(圖2A)。進一步檢測miR-222-3p mimics對SiHa細胞遷移能力的影響,細胞劃痕實驗的結果表明，miR-222-3p mimics促進SiHa細胞的遷移能力(圖2B)。通過Transwell實驗證實，miR-222-3p mimics增加SiHa細胞向Transwell下室侵襲的能力(圖2C)。

圖2 miR-222-3p促進SiHa細胞惡性生物學行為A.SiHa細胞轉染miR-222-3p mimics和mimics NC后的細胞活力變化；B.細胞劃痕實驗驗證miR-222-3p mimics對SiHa細胞遷移能力的影響；C.Transwell實驗檢測miR-31-5p mimics對SiHa細胞侵襲能力的影響;與mimics NC比較，*P<0.05,**P<0.01,***P=0.000

3.SOCS5是miR-222-3p的直接靶點：通過TargetScanHuman7.2(http://www.targetscan.org/vert_72/)預測發現，SOCS5是miR-222-3p的潛在靶點，而且其結合位點在脊椎動物中高度保守。熒光素酶報告基因實驗證實，共轉染野生型SOCS5和miR-222-3p mimics的熒光素酶活性顯著減低(圖3A)，表明SOCS5是miR-222-3p的直接靶點。蛋白免疫印跡實驗表明，轉染了miR-31-5p mimics的SiHa細胞的SOCS5蛋白水平顯著下調(圖3B)。為了證實SOCS5在miR-222-3p下游發揮作用，筆者進行如下實驗。將SOCS5過表達質粒轉染至SiHa細胞，SOCS5的蛋白表達水平顯著升高(圖3C)。CCK-8實驗結果顯示，共轉染miR-222-3p mimics和SOCS5過表達質粒的SiHa細胞活力明顯低于共轉染miR-222-3p mimics和空質粒的SiHa細胞活力(圖3C)。與之相一致的是，共轉染miR-222-3p mimics和SOCS5過表達質粒的SiHa細胞的遷移能力和侵襲能力均低于共轉染miR-222-3p mimics和空質粒的SiHa細胞(圖3D和圖3E)。

圖3 SOCS5在miR-222-3p下游調節SiHa細胞的生物學行為A.熒光素酶報告基因實驗驗證SOCS5是miR-222-3p直接靶點；B.轉染miR-222-3p mimics后SiHa細胞SOCS5的蛋白表達及灰度分析；C.共轉染miR-222-3p mimics和SOCS5過表達質粒對SiHa細胞活力的影響；D.共轉染miR-222-3p mimics和SOCS5過表達質粒對SiHa細胞遷移能力的影響；E.共轉染miR-222-3p mimics和SOCS5過表達質粒對SiHa細胞侵襲能力的影響；*P<0.05,**P<0.01,***P=0.000

討 論

在全球范圍內宮頸癌在女性惡性腫瘤中的發生率和病死率均排在第4位，在婦科相關惡性腫瘤中的發生率和病死率排在第2位，僅次于乳腺癌[1]。目前，早期篩查和疫苗的使用是預防宮頸癌發生和進展的重要手段[7，8]。盡管化療和手術對部分宮頸癌患者有效，但嚴重的不良反應和并發癥影響患者的生活質量和預后[9，10]。因此，闡明宮頸癌的發生、發展分子機制，有助于為患者提供更好的治療策略。

屬于非編碼RNA分子的miRNAs盡管不具備編碼蛋白的功能，卻可以通過調控mRNAs特定區域而影響蛋白表達，從而在細胞的多種生物學行為中發揮重要作用[11]。越來越多的研究表明，miRNAs介導的蛋白表達異常是宮頸癌發病機制的重要環節。Lü等[12]研究發現，miR-664在宮頸癌患者顯著低表達，過表達miR-664可以抑制c-Kit表達，進而誘導宮頸癌細胞凋亡增加。一項臨床研究顯示，miR-361-3p在宮頸癌樣本中低表達，而且與患者不良預后顯著相關[13]。除了下調表達，有些miRNAs在宮頸癌呈現顯著高表達。Chen等[14]通過檢測臨床樣本發現，miR-1246在宮頸癌患者顯著上調，而且提示淋巴結轉移的發生。進一步的細胞學研究表明，通過慢病毒介導的miR-1246下調可導致血小板反應蛋白-2的表達升高，從而促進宮頸癌細胞凋亡增加并抑制其增殖；小鼠荷瘤實驗也證實miR-1246的下調有助于抑制瘤體增長[15]。這些研究提示，miRNAs的差異表達在宮頸癌中發揮截然不同的作用。本研究表明，miR-222-3p在宮頸癌高表達，并促進宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲。此外，筆者發現SOCS5在miR-222-3p的下游發揮作用。

SOCS5是細胞因子信號轉導抑制子SOCS家族成員之一，通過調節JAK-STAT信號通路在腫瘤細胞凋亡和增殖中發揮關鍵作用[16]。Zhang等[17]研究發現，抑制SOCS5可促進JAK-STAT3信號通路活化，從而增加胰腺癌的侵襲和轉移。在急性T淋巴細胞性白血病中，沉默SOCS5的表達誘導JAK-STAT信號通路激活，促進疾病進展[18]。然而，SOCS家族成員在宮頸癌發病機制中的研究較少。國外的一項研究顯示，SOCS1在宮頸癌組織中低表達或無表達[19]。與此結果相一致，Kim等[20]研究發現，SOCS1、SOCS3和SOCS5在宮頸癌組織和細胞系均呈現表達減少。但SOCS5在宮頸癌中的功能學研究尚未見報道。筆者發現，過表達SOCS5可抑制miR-222-3p對宮頸癌細胞的促增殖、促遷移和促侵襲作用。

綜上所述，本研究通過體外實驗證實miR-222-3p具有促進宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用，而且其作用與抑制SOCS5表達有關。因此，這些結果初步提示miR-222-3p在宮頸癌的進展中發揮重要作用，為進一步明確其發病機制提供理論依據。