白腐乳發酵過程中細菌群落演替規律研究

周小虎，李 理

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510641）

中國傳統發酵豆制品醬油、豆豉、納豆、腐乳（sufu）在調味品中具有重要地位，而腐乳因其獨特而誘人的風味被稱為“中國奶酪”或“東方芝士”。腐乳可分為紅方、白方、青方以及其他各種花色腐乳，白腐乳因其獨特的風味和純凈的外觀在華南地區及海外擁有較大的市場[1-2]。

白腐乳的生產工藝包括大豆浸泡、打漿、濾漿、煮漿、點漿、壓榨成型、切塊，以及接種毛霉、前酵、加鹽腌制、灌湯后酵、包裝等。雖然接種了純種毛霉進行前期發酵[3]，但由于固態發酵是在開放的空間進行，環境中的微生物特別是細菌仍然可以進入并參與發酵，從而影響腐乳的品質。白腐乳在后酵過程中常常出現的白點[4]、脹蓋漏汁[5]等感官品質問題，均可能與后酵過程中的微生物相關。此外，也有報道顯示，腐乳生產原料豆腐可能被金黃色葡萄球菌、腸桿菌等食源致病菌污染而存在安全問題[6]。因此，解析白腐乳發酵過程中出現的細菌群落變化將對腐乳生產及產品質量提升具有很好的指導作用。

研究表明，高通量測序方法可以在脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）層面比較清晰地展示發酵體系中出現的微生物[7]，而傳統的培養組學則可以從發酵體系中得到純的菌種，可以進一步從菌種的角度進行深入的研究。目前，對腐乳菌群的研究主要集中在紅腐乳[8-10]，白腐乳菌群研究的報道較少。因此，本研究擬對白腐乳發酵過程的全過程（從前酵至后酵180 d）細菌群落的演替進行系統的研究，為進一步研究白腐乳發酵過程中的細菌群落變化對白腐乳品質的影響奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

實驗原料均采自廣東某腐乳廠同一批次生產的白腐乳樣品，實驗原料包括酸漿水（SJ）、白坯（BP）、毛坯（MP）、鹽坯（YP）、后酵45 d（CG45）、后酵90 d（CG90）、后酵180 d（CG180）。所有樣品均收集三份然后混勻凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.1.2 化學試劑

核酸熒光定量染料（P7589）：美國Invitrogen 公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Mix、Marker、DNA提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒：廣州東盛生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

MRS肉湯培養基、M17肉湯培養基、LB固體培養基、營養瓊脂（nutrient agar，NA）培養基：廣州環凱生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

IlluminaHiSeq2500高通量測序平臺：美國Illumina公司；DYY-6C電泳儀：北京六一生物科技有限公司；BG-gdsAUTO（130）凝膠成像系統：北京百晶生物技術有限公司；LDX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；SW-CJ-1C超凈工作臺蘇州凈化設備廠；MDF-86V50超低溫冰箱：安徽中科都菱電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白腐乳加工工藝流程及操作要點

操作要點：白腐乳生產工藝可分為四個階段。第一階段是豆腐的生產，包括泡豆、打漿、煮漿、點漿、蹲腦、擠壓成型等工藝，其中用于點漿的凝固劑是酸漿水，即自然發酵的豆腐乳清。第二階段，也稱為前期發酵階段，新鮮切好的豆腐塊（白坯）接種純種毛霉，在適當的條件下培養約48 h，待豆腐塊表面覆蓋著厚實的白色真菌菌絲結束（毛坯）。第三階段，將毛坯進行腌制，降低毛坯中的水分（鹽坯）。第四階段為后熟階段，將鹽坯裝罐并加入含有一定濃度的食鹽和酒精的湯汁，陳放1～6個月然后包裝白腐乳成品。

1.3.2 白腐乳發酵過程中細菌群落演替分析

對各個樣品按照試劑盒操作說明進行總DNA提取，并通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，同時采用紫外分光光度計對DNA進行定量。然后，以各樣本提取的總細菌基因組DNA為模板，以16S rRNA 基因V3-V4區特異引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對模板進行PCR擴增，PCR擴增體系（25 μL）：5×反應緩沖液（reaction buffer）5 μL，5×GC buffer 5 μL，脫氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5 mmol/L）2 μL，正向引物（Forward primer）（10 μmol/L）1 μL，反向引物（10 μmol/L）1 μL，DNA 模板2 μL，雙蒸水（ddH2O）8.75 μL，Q5 DNA聚合酶0.25 μL。PCR擴增參數：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴增30個循環；72 ℃末端延伸5 min。PCR擴增產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并對目標片段進行切膠回收。最后，送樣至派諾森生物使用Illumina MiSeq平臺進行高通量測序及生物信息學分析。

1.3.3 白腐乳發酵過程中可培養細菌的分離鑒定

采用傳統平板法對部分可培養細菌進行分離、純化，采用16S rDNA對分離的細菌進行鑒定。用于分菌的樣品及其采集和保存方法有1.1中所有樣品和后酵30 d腐乳（CG30），其采集和保存方法同1.1。

細菌的分離純化：在超凈臺中取5 g腐乳于研缽中（酸漿水取5 mL），研磨后加入45 mL生理鹽水混勻制備樣品液，在超凈臺中吸取1 mL樣品液于9 mL無菌生理鹽水中，依次稀釋至10-3、10-4、10-5倍，分別取100 μL用MRS和M17固體培養基依次傾注倒平板，分別取100 μL于LB、NA固體培養基涂布，于30 ℃的恒溫培養箱中，培養72 h。挑取單菌落液體培養，經平板劃線法進一步純化直至獲得單菌落。將分離得到的菌株編號并于-80 ℃冰箱甘油保藏備用。

分離菌株的鑒定：采用東盛生物細菌DNA提取試劑盒按照說明書步驟提取每個分離菌株的基因組DNA，然后使用16S rDNA通用引物（上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和下游引物1495R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）進行PCR擴增，PCR擴增體系為50 μL，包括：λDNA 1 μL，引物27F和引物1495R各2 μL，2×PCR Mix 20 μL，超純水25 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，42 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30次循環；72 ℃再延伸10 min。在瓊脂糖凝膠中加入GoldView染料制膠，取8.0 μLPCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠成像儀下觀察。然后利用PCR產物及DNA片段純化試劑盒按照其操作手冊從PCR反應液中回收DNA片段，將回收得到的DNA片段送到生工生物工程（廣州）公司進行DNA測序，將測得的DNA序列在美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）對比。

1.3.4 數據處理

數據分析使用Excel 2019、Origin 2018等軟件。生物信息學分析：采用滑動窗口法對FASTQ格式的雙端序列逐一作質量篩查，隨后利用FLASH軟件（v1.2.7）對通過質量初篩的雙端序列根據重疊堿基進行配對連接，根據每個樣本所對應的Index信息，將連接后的序列識別分配入對應樣本（要求Index序列完全匹配），從而獲得每個樣本的有效序列。對于每個OTU的代表序列，在QIIME軟件中使用默認參數，通過將OTU代表序列與對應數據庫的模板序列相比對，獲取每個OTU所對應的分類學信息，計算各樣本的Alpha多樣性。使用Origin 2018軟件，對關注的特定樣本在特定分類水平的組成繪制柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 白腐乳發酵過程中細菌群落演替分析

對于微生物群落而言，有多種指數來反映其Alpha多樣性。常用的度量指數主要包括側重于體現群落豐富度的Chao1指數和ACE指數，以及兼顧群落均勻度的Shannon指數和Simpson指數。一般而言，Chao1或ACE指數越大，表明群落的豐富度越高；Shannon指數對群落的豐富度以及稀有OTU更敏感，而Simpson指數對均勻度和群落中的優勢OTU更敏感。樣品Alpha多樣性指數結果見表1。由表1可知，毛坯中細菌群落的豐富度最高，白坯和后酵180 d樣品中細菌群落的豐富度最低。

表1 白腐乳各樣品中細菌群落測序的Alpha多樣性指數Table 1 Alpha-diversity indexes of bacterial community sequencing in each sample of white sufu

腐乳發酵過程中各樣品門水平、屬水平細菌群落相對豐度分布結果見圖1。由圖1A可知，在后酵45 d及以前樣品中厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）為優勢菌門；在整個發酵過程中厚壁菌門均為優勢菌門，尤其是在后酵45～180 d，厚壁菌門相對豐度均在92%以上。由圖1B可知，在酸漿水和白坯中相對豐度較高的有乳桿菌屬（Lactobacillus）、醋酸菌屬（Acetobacter）；毛坯中的優勢菌屬是庫特氏菌屬（Kurthia）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）；鹽坯中的優勢菌屬是庫特氏菌屬（Kurthia）、魏斯氏菌屬（Weissella）和不動桿菌屬（Acinetobacter）；后酵45 d樣品中的優勢菌屬是明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳球菌屬（Lactococcus）和四聯球菌屬（Tetragenococcus）；后酵90 d樣品中的優勢菌屬是庫特氏菌屬、明串珠菌屬和乳球菌屬；后酵180 d樣品中的優勢菌屬是四聯球菌屬、庫特氏菌屬和魏斯氏菌屬。

圖1 白腐乳發酵過程中細菌群落基于門水平（A）及屬水平（B）相對豐度Fig.1 Relative abundance of bacterial community in white sufu samples in the fermentation process based on phylum level (A) and genus level (B)

2.2 白腐乳發酵過程中可培養細菌的分離鑒定

利用DNA提取試劑盒提取分離菌株DNA，采用通用引物27F和1492R進行PCR擴增并進行瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖2。由圖2可知，所有條帶堿基數均在1 500 bp左右，條帶單一且清晰明亮，可進行PCR產物純化并測序。

圖2 部分菌株基于16S rDNA序列PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of 16S rDNA PCR amplification products of some isolated strains

對PCR產物純化并測序后，將測得的DNA序列在NCBI進行BLAST對比，相似度均在99%以上。從酸漿水、白坯、毛坯、后酵45 d、后酵90 d、后酵180 d 6個樣品中用MRS、M17、LB和NA四種培養基分離、純化和鑒定出64株細菌，結果見表2。

表2 白腐乳發酵過程中可培養細菌基于16S rDNA序列的分離鑒定結果Table 2 Isolation and identification results of culturable bacteria in the white sufu fermentation process based on 16S rDNA sequences

由表2可知，從酸漿水中主要分離鑒定出融合魏斯氏菌（Weissella confuse），其在白坯和毛坯中也大量分離到，而在白坯中還分離鑒定到了蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）；在毛坯中還分離鑒定到乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和糞腸球菌（Enterococcus faecalis），這兩種細菌在后酵45 d和90 d腐乳中均有分離到；除乳酸乳球菌外，后酵45 d和90 d樣品中還分離出較多的腸球菌；后酵180 d樣品中分離鑒定到蠟樣芽孢桿菌和乳酸乳球菌。

2.3 高通量測序與培養分離方法結合分析菌群變化

酸漿水中豐度較高的細菌有乳桿菌和醋酸菌，這和課題組先前的研究一致（樣品源自不同工廠）[11]，本實驗從酸漿水、白坯和毛坯中都分離到比較多的融合魏斯氏菌。魏斯氏菌是革蘭氏陽性細菌，細胞不運動，顯微鏡下菌體是短桿狀的，其廣泛分布于食物、土壤、胃腸道和呼吸道等環境中，其中一個分支由食竇魏斯氏菌和融合魏斯氏組成，它們常分布在含鹽的發酵食品中。魏斯氏菌是參與食品發酵的重要乳酸菌之一，對于發酵食品的發酵進程和風味有重要的影響和貢獻[12]。

序列分析的結果顯示，從毛坯開始出現乳球菌，且在后酵45～90 d樣品中乳球菌屬相對豐度較高，而通過培養組學分析，從白坯到后酵的各個階段均分離到多株乳酸乳球菌，說明乳球菌是白腐乳發酵過程中的主要細菌之一。乳酸乳球菌被廣泛應用于發酵乳制品中，對牛乳蛋白質的降解和酸奶風味具有重要的影響[13]。

明串珠菌屬在后酵45～150 d腐乳中相對豐度較高。明串珠菌屬是兼性厭氧菌，具有嗜溫性，廣泛存在于發酵蔬菜、肉制品等[14]，但并未分離到該菌。在白坯中分離到肉葡萄球菌，該菌對發酵香腸的風味有重要作用[15]。在后酵45～90 d腐乳中還分離鑒定到較多的糞腸球菌、耐久腸球菌及未鑒定到種的腸球菌，腸球菌在其他腐乳中也有分布[9]。有報道表明，某些芽孢桿菌、乳桿菌和腸桿菌會導致辣椒醬及豆瓣醬脹蓋[16-17]，本研究高通量測序結果顯示白腐乳發酵后期也存在一定的芽孢桿菌、乳桿菌和腸桿菌，因此后酵過程中某些活躍的芽孢桿菌、乳桿菌和腸桿菌可能對腐乳“脹蓋漏汁”產生影響。在白坯及后酵180 d腐乳中均分離到蠟樣芽孢桿菌，但在后酵階段不是優勢菌屬。

在腐乳成熟的后期，嗜鹽四聯球菌的豐度越來越高。雖然四聯球菌的豐度很高，一開始并未分離到該菌。后期通過文獻調研，在培養基中增補了氯化鈉后從后熟30 d腐乳中分離到11株嗜鹽四聯球菌（Tetragenococcus halophilus）。嗜鹽四聯球菌對鹽的耐受性較強，是一種革蘭氏陽性、四聚體形成、不活動、過氧化氫酶陰性、廣泛存在于高鹽發酵食品中的微生物[18-19]，在發酵食品中具有抑制組胺產生[20]、降解黃曲霉毒素B1的作用[21]，并且能夠產生風味物質[22]。后酵45 d和90 d腐乳中乳球菌、明串珠菌和四聯球菌等菌屬相對豐度較高，后酵180 d腐乳中四聯球菌、魏斯氏菌和乳桿菌等菌屬相對豐度較高，可能是由于這些菌屬的某些菌種對腐乳后酵體系的高鹽、微氧及復雜的營養環境具有較好的適應性，并且對其他微生物產生抑制作用。

值得關注的是，在發酵的過程中還出現了不動桿菌和庫特氏菌。不動桿菌屬在毛坯中的相對豐度最高，在發酵各階段都有存在，這和XU D D等[10]的研究結果一致；不動桿菌屬的部分種是有感染性的[23-24]，但大多數種是非致病的環境生物，不動桿菌屬也存在于其他各種發酵食品中[15，22]。庫特氏菌在鹽坯和后酵90 d樣品中豐度較高，在腐乳發酵過程中一直存在且有一定的波動，這與LIANG J J等[25]的結果相似。

對不同樣品進行細菌的分離鑒定，發現能夠分離鑒定出的細菌種類較少，并且純培養出的細菌菌屬不是該樣品豐度最高的菌屬，可能原因是培養基、培養條件不適合該樣品高豐度菌屬生長，或分菌時挑取菌數有限，而純培養出來的細菌是較適合實驗條件生長的，或是高通量測序方法可能檢測到死亡的微生物群的完整核苷酸序列[26-27]。

3 結論

通過高通量測序及培養分離結合的方法分析了白腐乳發酵過程中細菌群落演替。白腐乳從前酵到后酵180 d的整個發酵過程中細菌群落均有較大變化，從白坯、毛坯、后熟45 d腐乳至后熟180 d腐乳中的優勢菌屬分別為：乳酸桿菌屬、不動桿菌屬、明串珠菌屬和四聯球菌屬。從白腐乳生產及發酵過程中分離鑒定出75株細菌，包括融合魏斯氏菌（Weissella confusa）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、嗜鹽四聯球菌（Tetragenococcus halophilus）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）和耐久腸球菌（Enterococcus durans）等。