裂褶菌多糖發酵培養基優化及其活性研究

魯 鐵，陳懷中，金 陽，周牧野，劉 通，葉延欣，姬曉娜，劉 宇，李冰冰*

（1.河南城建學院生命科學與工程學院，河南平頂山 467036；2.平頂山健康食品協同創新中心，河南平頂山 467036；3.魯東大學農學院，山東煙臺 264025）

裂褶菌（Schizophyllum communeF.）又稱白參、樹花、八擔柴，隸屬于真菌門，擔子菌綱，傘菌目，裂褶菌科，裂褶菌屬（Schizophyllum），是一種具有較高食藥用價值的大型食用菌[1-2]，具有清肝明目、滋補強身的功效[3-4]，在我國主要分布于河北、黑龍江、安徽、江蘇、浙江、福建、海南等省份。

裂褶菌多糖（schizophyllan polysaccharide，SPG）又稱裂褶菌素，是裂褶菌主要的活性物質之一，其結構主要是β-（1→3）和β-（1→6）糖苷鍵組成的β-葡聚糖[5]。JAYAKUMAR G C等[6]研究發現，SPG具有廣譜性的抑菌活性，趙岳等[7]進一步證實SPG對假單胞桿菌（Pseudomonas syringae）和大腸桿菌（Escherichia coli）的抑制效果。MAYAKRISHNAN V等[8]研究發現，裂褶菌子實體的提取物具有一定的抗氧化活性，楊娜等[9]進一步證實SPG具有抗氧化活性。此外，周林等[10]對SPG的保濕性能進行了評價，結果表明SPG是化妝品較優良的保濕性原料。

SPG來源于裂褶菌的子實體、發酵液和菌絲體。使用發酵手段獲取SPG利于規模化的開發利用。SINGH M K等[11]使用以銀合歡（Leucaena leucocephala）木粉碎物為主成分等14種組分的培養基進行發酵產SPG，產量達到4.2 g/L；吳麗華[12]發現發酵培養基中添加聚合物如谷氨酸及透明質酸等可以提高發酵體系的溶氧傳質效率，從而提升SPG的產量。

本研究以胞內總多糖產量為評價指標，在單因素試驗確定對發酵影響較大的主效碳、氮源基礎上，采用Box-Benhnken響應面試驗考量3種聚合物（羥甲基淀粉鈉、透明質酸、β-環糊精）及谷氨酰胺、抗壞血酸、KH2PO4復合體系對裂褶菌產多糖的影響，確定裂褶菌液態深層發酵產多糖的最佳培養基配方，并對其抑菌活性、抗氧化性及保濕活性進行研究，以期為裂褶菌多糖的開發利用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

裂褶菌（Schizophyllum commune）經野外組織分離，保存于本實驗室，編號為SCLT NO.990715。

1.1.2 試劑

葡萄糖標準品（純度≥98%）：天津市優譜化學試劑有限公司；1,1-二苯肼-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl2-picrylhydrazyl，DPPH）：北京索萊寶科技有限公司；2,2'-聯氨雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（2,2'-azino-bis（3-ethbenzothiazoline-6-sulfonicacid）diammoniumsalt，ABTS）（純度≥98%）、水楊酸（純度≥98%）：宜興市申光醫藥化工有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

斜面培養基、活化培養基使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基，121 ℃高壓滅菌20 min。

液體種子培養基[13]：馬鈴薯200 g，葡萄糖10 g，蔗糖10 g，酵母膏2 g，牛肉膏2 g，蛋白胨2 g，KH2PO42 g，MgSO41 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min。

發酵培養基[14]：葡萄糖20 g，酵母浸粉6 g，KH2PO41 g，抗壞血酸0.01 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

DLHR-D 2802型恒溫振蕩培養箱：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；Spectronic 200型紫外分光光度計：美國賽默非世爾科技公司；GFL-125型電熱鼓風干燥箱：天津萊玻特瑞儀器有限公司；MJ-78A型高壓蒸汽滅菌鍋：上海施都凱儀器設備有限公司；SW-CJ-2F型無菌操作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；KDC-1044型低速離心機：科大創新股份有限公司；Biotech-10BG2A型發酵罐：上海虔鈞科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 裂褶菌的發酵培養

菌種的活化：將4 ℃低溫保存的斜面試管菌種接種到活化培養基中，25 ℃條件下培養5～10 d，待其長滿后接種。

種子液的制備：使用打孔器取5塊直徑為1 cm的菌塊，接入種子培養基，裝液量為100 mL/250 mL，于25 ℃、150 r/min條件下培養5 d。

裂褶菌液態深層發酵培養：將種子液按5%（V/V）的接種量接種于液體發酵培養基，裝液量為100 mL/250 mL，于25 ℃、150 r/min條件下培養5 d。

1.3.2 裂褶菌液態深層發酵培養基優化

（1）最佳碳源與氮源的確定：改變發酵培養基中的碳源為乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖，質量濃度為20 g/L，改變發酵培養基中的氮源為酵母浸粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，質量濃度為6 g/L，其他組分不變，25 ℃、150 r/min條件下搖床培養5 d，研究不同碳源對裂褶菌胞內總多糖產量的影響，篩選出最佳碳源與氮源。

（2）裂褶菌液態深層發酵培養基優化響應面試驗

確定最佳的碳氮源后，以胞內總多糖產量（Y）為考察指標，選擇碳源（X1）、氮源（X2）、KH2PO4（X3）、β-環糊精（X4）、透明質酸（X5）、抗壞血酸（X6）、羧甲基淀粉鈉添加量（X7）和谷氨酰胺（X8）共計8個因素進行Plackett-Burman試驗，考察8個因素對裂褶菌胞內總多糖產量影響的正負效應，試驗因素與水平見表1。

表1 Placket-Burman試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Placket-Burman tests

依據Plackett-Burman試驗結果確定顯著因子，根據各因素影響的正負效應設計最陡爬坡試驗的方向和步長，通過最陡爬坡試驗確定顯著因子水平的中心值。在最陡爬坡試驗結果的基礎上，進行Box-Benhnken響應面試驗。

1.3.3 裂褶菌胞內總多糖產量的測定

裂褶菌菌絲體干質量的測定參照文獻[15]的方法；裂褶菌菌絲體粗多糖的提取步驟參照文獻[16]的方法；裂褶菌多糖質量分數的測定參照文獻[17]，總多糖產量的計算方法參照文獻[15]。

1.3.4 發酵曲線試驗

采用最優發酵培養基培養裂褶菌，測定胞內總多糖產量繪制發酵曲線，確定搖床發酵階段的最優培養時間。

1.3.5 發酵罐試驗

在搖床培養的基礎之上，進行發酵罐培養試驗，將種子培養液以10%（V/V）的接種量接種于10 L發酵罐中，裝液量6 L，攪拌轉速300 r/min，通氣量1.00～2.00 vvm，25 ℃，培養7 d，pH自然。通過測定胞內總多糖產量繪制發酵曲線，確定通過發酵罐培養獲得最大產量的時間。

1.3.6 裂褶菌多糖抑菌活性測定

參照文獻[18]，以青霉素為陽性對照，采用二倍稀釋法配制質量濃度分別為0.625 mg/mL、1.250 mg/mL、5.000 mg/mL、10.000 mg/mL的裂褶菌粗多糖溶液，利用紫外分光度法探究裂褶菌多糖對大腸桿菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃葡萄球菌的抑菌活性，并計算抑菌率，其計算公式如下：

式中：A0為空白對照吸光度值；A1為樣品測定管吸光度值；A2為樣品本底管吸光度值。

1.3.7 裂褶菌多糖抗氧化性測定

以維生素C（vitamin C，VC）為陽性對照，采用二倍稀釋法配制成質量濃度分別為0.125 mg/mL、0.250 mg/mL、0.500 mg/mL、1.000 mg/mL、2.000 mg/mL的裂褶菌粗多糖溶液，參照文獻[19]測定其·O2-清除率，參照文獻[20]測定其DPPH·及·OH清除率，參照文獻[21]測定其ABTS自由基清除率。

1.3.8 裂褶菌多糖保濕性測定

以透明質酸為陽性對照，參照文獻[22]測定質量濃度為2.00 mg/mL的裂褶菌多糖在相對濕度（relative humidity，RH）分別為43%和81%條件下放置8 h的保濕率。

2 結果與分析

2.1 碳源與氮源種類的確定

碳、氮源對裂褶菌液態深層發酵的影響結果見圖1。由圖1可知，葡萄糖作為碳源時，總多糖產量最高，為2.24 g/L；酵母浸粉作為氮源時，總多糖產量最高，為2.49 g/L。因此，確定葡萄糖、酵母浸粉分別為最佳碳、氮源。

圖1 不同的碳源、氮源對裂褶菌液態深層發酵的影響Fig.1 Effect of different carbon source and nitrogen source on the submerged fermentation of Schizophyllum commune

2.2 裂褶菌液態深層發酵培養基優化響應面試驗

2.2.1 Plackett-Burman試驗

Plackett-Burman試驗設計及結果見表2，各因素效應分析見表3，方差分析見表4。

表2 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 2 Design and results of Plackett-Burman tests

表3 Plackett-Burman試驗各因素的效應分析Table 3 Effect analysis of each factor of Plackett-Burman tests

由表3可知，酵母浸粉（X2）、β-環糊精（X4）和抗壞血酸（X6）的貢獻值分別為58.61%、17.03%、6.79%，對裂褶菌總多糖產量的影響最大，且酵母浸粉（X2）和β-環糊精（X4）影響為正效應，抗壞血酸（X6）影響為負效應，選擇這三個因素進行最陡爬坡試驗。其他組分，葡萄糖（X1）、KH2PO4（X3）、透明質酸（X5）為正效應，分別使用20.0 g/L、0.6 g/L和0.1 g/L，羥甲基淀粉鈉（X7）、谷氨酰胺（X8）為負效應，分別使用3.0 g/L和0.000 5 g/L。由表4可知，模型的P值＜0.01，說明模型所擬合的方程達到極顯著水平。

表4 Plackett-Burman試驗回歸模型的方差分析Table 4 Variance analyses of regression model for Plackett-Burman tests

2.2.2 最陡爬坡試驗

根據Plackett-Burman試驗的結果選擇合適的步長對酵母浸粉（A）、β-環糊精（B）和抗壞血酸（C）進行最陡爬坡試驗，試驗設計與結果見表5。

表5 最陡爬坡試驗設計與結果Table 5 Design and results of the steepest ascent tests

由表5可知，第4組試驗條件下，即酵母浸粉30 g/L、β-環糊精16 g/L、抗壞血酸0.006 g/L時，裂褶菌總多糖產量最高，為12.84 g/L。因此，以第4組試驗因素的水平為中心點進行Box-Benhnken試驗。

2.2.3 Box-Benhnken試驗

根據最陡爬坡試驗結果設計Box-Benhnken試驗，試驗結果與分析見表6，方差分析見表7。

表6 Box-Behnken試驗設計與結果Table 6 Design and results of Box-Behnken tests

利用統計軟件Design-Expert10.0.4.0對表6的試驗結果進行多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程：

表7 Box-Behnken試驗回歸模型的方差分析Table 7 Variance analysis of regression model of Box-Behnken tests

由表7可知，模型的P值＜0.01，極顯著，失擬項P值＞0.05，不顯著，說明所構建的模型很好，與試驗的差異較小；決定系數R2為0.910 2，調整決定系數R2adj為0.794 8，說明預測值與試驗值有較好的相關性，試驗誤差較小；模型的信噪比為7.879，遠大于4，則表明該模型適合用于裂褶菌菌絲體總多糖產量的預測。在該模型中，一次項B、二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。根據F值大小可知，各因素對裂褶菌胞內總多糖產量影響的主次順序為：β-環糊精添加量（B）＞酵母浸粉添加量（A）＞抗壞血酸添加量（C）。各因素間交互作用的響應面及等高線見圖2。

圖2 各因素間交互作用對裂褶菌總多糖產量影響的響應面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on the yield of total schizophyllan polysaccharide fromSchizophyllum commune

由圖2可知，響應曲面呈向上的凸面，說明存在最大值；等高線接近圓形，說明各因素間交互作用對裂褶菌胞內總多糖產量的影響不顯著，與方差分析結果一致。

對擬合出的二次多項式回歸方程分別求A、B和C的偏導數，得到裂褶菌菌絲體產多糖的最優培養基為酵母浸粉29.402 g/L、β-環糊精17.006 g/L、抗壞血酸0.006 g/L，裂褶菌胞內總多糖產量最高理論值為3.765 g/L。考慮到實際操作的可行性，將培養基組分調整為酵母浸粉29.5 g/L、β-環糊精17.0 g/L、抗壞血酸0.006 g/L，其他組分為葡萄糖20 g/L、KH2PO40.6 g/L、谷氨酰胺0.000 5 g/L、透明質酸0.05 g/L、羧甲基淀粉鈉3 g/L。

在此條件下通過3次平行重復試驗驗證，測得實際胞內總多糖產量為3.715 g/L，與理論偏差為1.33%。實際值與理論值基本相符，說明采用響應面法優化得到的發酵培養基參數可靠，具有一定參考價值。

2.3 搖瓶發酵曲線試驗結果

在最優培養基下，裂褶菌搖瓶發酵產多糖曲線見圖3。由圖3可知，裂褶菌發酵11 d時，總多糖產量最高，為5.35 g/L。因此，確定搖瓶發酵裂褶菌產總多糖的最佳培養時間為11d。

圖3 裂褶菌總多糖產量的變化曲線Fig.3 Change curve of total schizophyllan polysaccharide yield

2.4 發酵罐試驗結果

在最優培養基下，采用10 L發酵罐對裂褶菌進行發酵，發酵曲線見圖4。由圖4可知，當發酵6 d時，總多糖產量最高，為6.39 g/L。為裂褶菌進一步中試生產提供了試驗依據。

圖4 最佳培養條件下裂褶菌總多糖產量的變化曲線Fig.4 Change curve of total schizophyllan polysaccharide yield under the optimal culture condition

2.5 裂褶菌多糖活性研究結果

2.5.1 抑菌試驗結果

由圖5可知，裂褶菌多糖質量濃度在0.625～10.000mg/mL范圍內對4種指示菌的抑制作用均呈正相關關系，且抑制率均低于陽性對照（青霉素）。當裂褶菌多糖質量濃度為10 mg/mL時，抑菌率均達到最大，對大腸桿菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌率分別為56.24%、33.75%、32.62%、42.51%。結果表明，裂褶菌多糖溶液對4種指示菌均具有抑制作用。

圖5 裂褶菌多糖對不同細菌的抑菌率Fig.5 Antibacterial rate of schizophyllan polysaccharide on different bacteria

2.5.2 抗氧化活性試驗結果

圖6 裂褶菌多糖對不同自由基的清除率Fig.6 Scavenging rate of schizophyllan polysaccharide on different free radicals

裂褶菌多糖對·O2-、·OH、DPPH·和ABTS自由基的清除作用見圖6。由圖6可知，裂褶菌多糖質量濃度在0.125～2.000 mg/mL的范圍內對四種不同的自由基的清除作用呈正相關關系，且清除率均低于陽性對照（VC）。當裂褶菌多糖質量濃度為2.000 mg/mL時，自由基清除率均達到最大，對·O2-、·OH、DPPH·和ABTS自由基的清除率分別為84.58%、15.08%、18.61%和32.60%。結果表明，裂褶菌多糖對4種自由基均具有清除作用。

2.5.3 保濕活性試驗結果

裂褶菌的保濕性見圖7。由圖7可知，在RH 43%和RH 81%的環境中，放置0～6 h，裂褶菌多糖的保濕性與透明質酸的一致，僅在8 h后裂褶菌多糖的保濕率下降至98.2%，保濕活性略低于透明質酸。結果表明，裂褶菌多糖具有很強的保濕活性，略低于透明質酸。

圖7 裂褶菌多糖在不同濕度環境下的保濕率Fig.7 Moisture-retention of schizophyllan polysaccharide under different humidity environment

3 結論

通過單因素和響應面試驗確定裂褶菌液態深層發酵產胞內多糖最佳發酵培養基配方為葡萄糖20.0 g/L、酵母浸粉29.5 g/L、KH2PO40.6 g/L、抗壞血酸0.006 g/L、β-環糊精17 g/L、谷氨酰胺0.000 5 g/L、透明質酸0.05 g/L、羧甲基淀粉鈉3 g/L，采用最優培養基搖瓶發酵11 d，總多糖產量為5.35 g/L，10 L發酵罐發酵6 d，總多糖產量為6.39 g/L。當裂褶菌多糖質量濃度為2 mg/mL時，對·O2-、·OH、DPPH·和ABTS自由基的清除率分別為84.58%、15.08%、18.61%和32.6%；當裂褶菌多糖質量濃度為10 mg/mL時，對大腸桿菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率分別為56.24%、33.75%、32.62%和42.51%；在RH 43%和RH 81%的環境下放置8 h內，裂褶菌多糖溶液的保濕性均高于98%。結果表明，裂褶菌多糖具有較好的抗氧化、抑菌、保濕性能，其具有應用于食品、化妝品領域的潛力。