響應(yīng)面法優(yōu)化抗性糊精制備工藝

徐 慧，王珊珊，田延軍，劉 星，李瑞國，韓延雷，劉建軍

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，山東濟(jì)南 250013）

膳食纖維被稱作人體“第七大營養(yǎng)素”，可以有效緩解和治療因脂肪、糖類攝入過量而膳食纖維攝入過少所導(dǎo)致的肥胖病、心血管病、糖尿病等“文明病”、“富貴病”，是維持人類健康不可缺少的物質(zhì)[1-2]。膳食纖維作為一種人體必需的功能性營養(yǎng)成分，可以降低血糖、調(diào)節(jié)血脂，改善人體腸道菌群組成、促進(jìn)腸道蠕動等功效[3-5]。根據(jù)膳食纖維溶解度的不同，可以分為水溶性膳食纖維和水不溶性膳食纖維兩大類[6]。抗性糊精是淀粉深加工的重要產(chǎn)物之一，是一種低分子水溶性膳食纖維[7-8]。由于抗性糊精甜度低、溶解性高、無異味、黏度低等特性，在乳制品、面制品、肉制品、嬰兒食品、保健品、飲料業(yè)中都有廣泛的應(yīng)用前景[9-14]。抗性糊精現(xiàn)已應(yīng)用于清涼飲料、果汁飲料、調(diào)味料、果子醬等的生產(chǎn)[15-16]。

BARCZYNSKA R等[17]以馬鈴薯淀粉為原料分析檸檬酸催化劑對抗性糊精含量、純度等的影響，并對其進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵過程中對其進(jìn)行色譜分析；JOCHYM K等[18]用高溫?zé)峤怦R鈴薯淀粉不同時間制備抗性糊精，然后對其紅外結(jié)構(gòu)、水溶性、鏈長分布、分子質(zhì)量分布等進(jìn)行研究。而我國在20世紀(jì)90年代才開始研究抗性糊精，徐佩琳[19]以玉米淀粉為原料經(jīng)高溫酸解和α-淀粉酶及糖化酶的酶解制備抗性糊精。劉宗利等[20]將干淀粉經(jīng)過兩次的糊精化，并與酶解反應(yīng)相結(jié)合，通過控制反應(yīng)條件，顯著提高了抗性糊精的純度，膳食纖維含量達(dá)到了90%以上。馬夢垚等[21]利用一種特殊裝置制備抗性糊精，制得的產(chǎn)品顏色淺，含量達(dá)到了80%以上。

本研究以食用玉米淀粉為原料，主要針對酶法制抗性糊精時的酶解工藝進(jìn)行研究，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化酶解工藝，為抗性糊精的綜合開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食用玉米淀粉：濱州金匯玉米開發(fā)有限公司；耐高溫α-淀粉酶（8 000 U/g）、轉(zhuǎn)苷酶（6 000 U/g）：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NBD-9023AW型鼓風(fēng)干燥箱：諾巴迪材料科技有限公司；UB-7型pH計：丹佛儀器（北京）有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 焦糊精的制備及抗性糊精產(chǎn)率計算

將玉米淀粉置于烘箱中，110 ℃烘干至水分含量5%以下，酸化，每10 g淀粉加入5 mL 1%的鹽酸，混勻后酸浸1 h，抽濾，置于恒溫干燥箱中，110 ℃烘干至恒質(zhì)量，170 ℃酸解90 min，即得到焦糊精樣品。

取10 g左右焦糊精樣品（精確至0.01 g），加入3倍體積水，振蕩搖勻，酶解（先用α-淀粉酶斷開淀粉分子中的α-1,4糖苷鍵，將淀粉降解成小分子鏈，然后再用轉(zhuǎn)苷酶將這些小分子以α-1,6糖苷鍵連接到直鏈淀粉上）。加入4倍體積乙醇，振蕩搖勻，靜置，將沉淀物置于烘箱中，105 ℃烘干。抗性糊精產(chǎn)率計算公式如下：

1.3.2 酶解工藝優(yōu)化單因素試驗（1）α-淀粉酶作用溫度

設(shè)置α-淀粉酶作用溫度93 ℃、94 ℃、95 ℃、96 ℃、97 ℃，α-淀粉酶添加量0.5%，α-淀粉酶作用時間2.0 h，轉(zhuǎn)苷酶作用溫度55 ℃，轉(zhuǎn)苷酶添加量0.3%，轉(zhuǎn)苷酶作用時間16 h，酶解，考察酶作用溫度對抗性糊精產(chǎn)率的影響。

（2）α-淀粉酶添加量

設(shè)置α-淀粉酶添加量0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%，α-淀粉酶作用溫度94 ℃，α-淀粉酶作用時間2.0 h，轉(zhuǎn)苷酶作用溫度55 ℃，轉(zhuǎn)苷酶添加量0.3%，轉(zhuǎn)苷酶作用時間16 h，酶解，考察α-淀粉酶添加量對抗性糊精產(chǎn)率的影響。

（3）α-淀粉酶作用時間

設(shè)置α-淀粉酶作用時間1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h，α-淀粉酶作用溫度94 ℃，α-淀粉酶添加量0.4%，轉(zhuǎn)苷酶作用溫度55 ℃，轉(zhuǎn)苷酶添加量0.3%，轉(zhuǎn)苷酶作用時間16 h，酶解，考察α-淀粉酶作用時間對抗性糊精產(chǎn)率的影響。

（4）轉(zhuǎn)苷酶作用溫度

設(shè)置轉(zhuǎn)苷酶作用溫度53 ℃、54 ℃、55 ℃、56 ℃、57 ℃，α-淀粉酶作用溫度94 ℃，α-淀粉酶添加量0.4%，α-淀粉酶作用時間2.0 h，轉(zhuǎn)苷酶添加量為0.3%，轉(zhuǎn)苷酶作用時間為16 h，酶解，計算抗性糊精產(chǎn)率的影響。

（5）轉(zhuǎn)苷酶添加量

設(shè)置轉(zhuǎn)苷酶添加量為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，α-淀粉酶作用溫度94 ℃，α-淀粉酶添加量0.4%，α-淀粉酶作用時間2.0 h，轉(zhuǎn)苷酶作用溫度56 ℃，轉(zhuǎn)苷酶作用時間16 h，酶解，考察轉(zhuǎn)苷酶添加量對抗性糊精產(chǎn)率的影響。

（6）轉(zhuǎn)苷酶作用時間

設(shè)置轉(zhuǎn)苷酶作用時間12 h、14 h、16 h、18 h、20 h，α-淀粉酶作用溫度94 ℃，α-淀粉酶添加量0.4%，α-淀粉酶作用時間2.0 h，轉(zhuǎn)苷酶作用溫度56 ℃，轉(zhuǎn)苷酶添加量0.3%，酶解，考察轉(zhuǎn)苷酶作用時間對抗性糊精產(chǎn)率的影響。

1.3.3 Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以α-淀粉酶作用溫度（A）、α-淀粉酶添加量（B）、轉(zhuǎn)苷酶作用溫度（C）、轉(zhuǎn)苷酶添加量（D）進(jìn)行響應(yīng)面Box-Behnken試驗設(shè)計，以抗性糊精產(chǎn)率（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行酶解工藝的優(yōu)化。Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1α-淀粉酶作用溫度對抗性糊精產(chǎn)率的影響

圖1 α-淀粉酶作用溫度對抗性糊精產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of reaction temperature of α-amylase on resistant dextrin yield

由圖1可知，隨著α-淀粉酶的作用溫度在93～94 ℃范圍提高，抗性糊精產(chǎn)率呈上升趨勢；當(dāng)α-淀粉酶作用溫度為94℃時，所得抗性糊精產(chǎn)率最高，達(dá)到81.33%；在α-淀粉酶作用溫度＞94℃之后，抗性糊精產(chǎn)率逐漸降低。可能是由于溫度過高，影響了α-淀粉酶活性，導(dǎo)致抗性糊精產(chǎn)率下降。因此，選擇最適α-淀粉酶作用溫度為94 ℃。

2.1.2α-淀粉酶添加量對抗性糊精產(chǎn)率的影響

由圖2可知，在加入α-淀粉酶含量為0.3%～0.4%時，隨著α-淀粉酶添加量增加，抗性糊精產(chǎn)率加大；當(dāng)α-淀粉酶添加量為0.4%時，抗性糊精產(chǎn)率達(dá)到最大值，為80.10%；α-淀粉酶添加量＞0.4%之后，抗性糊精產(chǎn)率稍有下降。綜合考慮，選擇最佳α-淀粉酶添加量為0.4%。

圖2 α-淀粉酶添加量對抗性糊精產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of α-amylase addition on resistant dextrin yield

2.1.3α-淀粉酶作用時間對抗性糊精產(chǎn)率的影響

圖3 α-淀粉酶作用時間對抗性糊精產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of reaction time of α-amylase on resistant dextrin yield

由圖3可知，α-淀粉酶作用時間在1.0～2.5 h時，隨著酶解時間的延長，抗性糊精產(chǎn)率也逐漸上升；當(dāng)酶解時間為2.5 h，抗性糊精產(chǎn)率達(dá)到最大值，為81.43%；當(dāng)酶解時間＞2.5 h之后，隨著α-淀粉酶作用時間的延長，抗性糊精產(chǎn)率稍有下降。因此，選擇最適α-淀粉酶作用時間為2.5 h。

2.1.4 轉(zhuǎn)苷酶作用溫度對抗性糊精產(chǎn)率的影響

圖4 轉(zhuǎn)苷酶作用溫度對抗性糊精產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of reaction temperature of trans-glycosidase on resistant dextrin yield

由圖4可知，隨著轉(zhuǎn)苷酶作用溫度在53～56 ℃范圍內(nèi)的上升，抗性糊精產(chǎn)率不斷增加；當(dāng)轉(zhuǎn)苷酶作用溫度為56 ℃時，抗性糊精產(chǎn)率達(dá)到最大值，為81.91%；當(dāng)轉(zhuǎn)苷酶作用溫度＞56 ℃之后，抗性糊精含量減少，可能是由于作用溫度的升高，超過了最佳酶解溫度，導(dǎo)致酶活性減弱，抗性糊精產(chǎn)率下降。因此，選擇最適轉(zhuǎn)苷酶作用溫度為56 ℃。

2.1.5 轉(zhuǎn)苷酶添加量對抗性糊精產(chǎn)率的影響

圖5 轉(zhuǎn)苷酶添加量對抗性糊精產(chǎn)率的影響Fig.5 Effect of trans-glycosidase addition on resistant dextrin yield

由圖5可知，隨著轉(zhuǎn)苷酶添加量在0.1%～0.3%范圍內(nèi)增加，抗性糊精產(chǎn)率隨之逐漸增大，當(dāng)轉(zhuǎn)苷酶添加量達(dá)到0.3%時，抗性糊精產(chǎn)率達(dá)到最大值，為81.20%；當(dāng)轉(zhuǎn)苷酶添加量＞0.3%之后，抗性糊精的產(chǎn)率不再有明顯增加，因此，選擇最適轉(zhuǎn)苷酶添加量為0.3%。

2.1.6 轉(zhuǎn)苷酶作用時間對抗性糊精產(chǎn)率的影響

圖6 轉(zhuǎn)苷酶作用時間對抗性糊精產(chǎn)率的影響Fig.6 Effect of reaction time of trans-glycosidase on resistant dextrin yield

由圖6可知，隨著轉(zhuǎn)苷酶作用時間在12～18 h范圍內(nèi)延長，抗性糊精的產(chǎn)率隨之增加；當(dāng)轉(zhuǎn)苷酶作用時間為18 h時，抗性糊精產(chǎn)率達(dá)到最大值，為82.92%；當(dāng)轉(zhuǎn)苷酶作用時間＞18 h之后，抗性糊精含量稍有下降，因此，選擇最適轉(zhuǎn)苷酶作用時間為18 h。

2.2 酶解工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗[22-23]

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以抗性糊精產(chǎn)率（Y）為響應(yīng)值，選取α-淀粉酶作用溫度（A）、α-淀粉酶添加量（B）、轉(zhuǎn)苷酶作用溫度（C）、轉(zhuǎn)苷酶添加量（D）進(jìn)行4因素3水平的Box-Behnken試驗優(yōu)化設(shè)計。試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

利用軟件Design-Expert 8.0.6對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得關(guān)于α-淀粉酶作用溫度、α-淀粉酶添加量、轉(zhuǎn)苷酶作用溫度、轉(zhuǎn)苷酶添加量的二次回歸方程：Y=83.75+0.46A-0.27B-0.18C+0.13D+0.25AB-0.34AC+0.43AD-0.082BC-1.12BD-0.49CD-6.00A2-1.49B2-2.77C2-1.84D2

由表3可知，該回歸模型的P＜0.000 1，表明該方程模型達(dá)到極顯著（P＜0.01），證明實驗方法可行；失擬項P＞0.05，表明不顯著；該模型決定系數(shù)R2=0.995 5，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.991 0，表明擬合程度良好，實驗誤差較小。因此該回歸模型成立，可以利用此模型對抗性糊精的酶解工藝進(jìn)行分析及預(yù)測。影響抗性糊精產(chǎn)率的因素順序為α-淀粉酶作用溫度＞α-淀粉酶添加量＞轉(zhuǎn)苷酶作用溫度＞轉(zhuǎn)苷酶添加量，其中α-淀粉酶作用溫度和α-淀粉酶添加量對結(jié)果的影響極顯著（P＜0.01），α-淀粉酶作用溫度和轉(zhuǎn)苷酶作用溫度的交互作用、α-淀粉酶作用溫度和轉(zhuǎn)苷酶添加量的交互作用對結(jié)果的影響顯著（P＜0.05），α-淀粉酶添加量和轉(zhuǎn)苷酶添加量的交互作用、轉(zhuǎn)苷酶作用溫度和轉(zhuǎn)苷酶添加量的交互作用對結(jié)果的影響極顯著（P＜0.01）。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

根據(jù)回歸方程得到α-淀粉酶作用溫度、α-淀粉酶添加量、轉(zhuǎn)苷酶作用溫度和轉(zhuǎn)苷酶添加量之間的交互作用對抗性糊精產(chǎn)率影響的響應(yīng)面及等高線見圖7。由圖7可知，各交互因素的最佳作用點基本都落在試驗范圍內(nèi)，經(jīng)過軟件Design-Expert 8.0.6優(yōu)化，得到抗性糊精產(chǎn)率最大值時的最佳工藝條件為：α-淀粉酶作用溫度94.04 ℃，α-淀粉酶添加量0.39%，轉(zhuǎn)苷酶作用溫度55.96 ℃，轉(zhuǎn)苷酶添加量0.31%，該工藝下抗性糊精產(chǎn)率理論值為83.78%。

2.3 驗證試驗

考慮實際需要對上述工藝條件進(jìn)行調(diào)整，即α-淀粉酶作用溫度94℃，α-淀粉酶添加量0.4%，轉(zhuǎn)苷酶作用溫度56 ℃，轉(zhuǎn)苷酶添加量0.3%。進(jìn)行3次驗證試驗，得到抗性糊精產(chǎn)率實際值為82.56%，與預(yù)測值相對誤差為1.46%，結(jié)果表明，經(jīng)過響應(yīng)回歸方程擬合出的理論值與實際值偏差較小，表明得到的該模型有一定的實踐指導(dǎo)意義。

圖7 各因素交互作用對抗性糊精產(chǎn)率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effect of interaction of various factors on resistant dextrin yield

3 結(jié)論

采用單因素及響應(yīng)面試驗，建立了抗性糊精產(chǎn)率的二次多項擬合方程及三維響應(yīng)面圖，確定影響抗性糊精產(chǎn)率的因素順序為α-淀粉酶作用溫度＞α-淀粉酶添加量＞轉(zhuǎn)苷酶作用溫度＞轉(zhuǎn)苷酶添加量。由該模型得到優(yōu)化的酶解工藝條件為α-淀粉酶作用溫度94 ℃，α-淀粉酶添加量0.4%，轉(zhuǎn)苷酶作用溫度56 ℃，轉(zhuǎn)苷酶添加量0.3%。進(jìn)行3次驗證試驗，得到抗性糊精產(chǎn)率為82.56%。