柑橘果渣固態發酵產聚半乳糖醛酸酶

王祺安，馬 賀，肖 炎，黎循航，2*

（1.江西農業大學生物科學與工程學院，江西南昌 330045；2.江西農業大學應用微生物研究所，江西南昌 330045）

果膠主要由雜多糖構成，是植物組織結構的重要組成部分。其主碳鏈骨架結構以1,4-糖苷鍵將α-D-半乳糖醛酸聚合而成[1]。果膠酶是已獲重要工農業應用的酶，其使用量約占商業酶產量的25%。這些酶在食品工業中有多種應用，如果汁的澄清、植物油的提取、咖啡和可可的固化、植物纖維的精制和無果膠淀粉的制造[2-4]。果膠酶由復雜多樣的果膠降解復合酶系組成，可通過不同的反應機制和作用模式水解或裂解果膠。它們可分為果膠酯酶和解聚酶，前者將果膠鏈的酯化部分皂化，而后者作用為裂解和水解果膠鏈。在復合酶系中，聚半乳糖醛酸酶是起水解作用的主要酶，可催化半乳糖醛酸α-1,4-糖苷鍵的水解斷裂[5]。聚半乳糖醛酸酶的最適pH值通常在酸性范圍內，適用于果汁、蔬菜汁和葡萄酒等的浸漬、液化、提取、澄清[6-7]，而受到廣泛關注。

果膠酶廣泛存在于高等植物中，參與某些果實成熟過程果膠物質的修飾。雖然果膠酶可從植物、動物等多種來源獲得，但只有微生物來源的果膠酶才能滿足工業化生產需求。但由于果膠酶生產成本高（培養基成本占總成本的30%～40%），而限制了它的應用。因此，探索利用特定微生物轉化廉價底物發酵合成胞外果膠酶成為一種有意義的嘗試[8]。許多研究表明，絲狀真菌是產生聚半乳糖醛酸酶的主要微生物，如黑曲霉（Aspergillus niger）[4]、煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）[9]、擴展青霉（Penicillium expansum）[10]等。

現今，人們更加關注固態發酵方式在聚半乳糖醛酸酶生產中應用。與深層發酵相比，固態發酵具有需水量少、所需溶劑少、真菌生長條件好、產液量少、濃度高、產酶量大等優點。這些優勢在生物質和農工業剩余物豐富的產業中獲得了特殊的經濟利益[11]。ZHENG Z等[6]研究以蘋果渣、蔓越橘渣和草莓渣作為底物對香菇（Lentinus edodes）CY-35合成聚半乳糖醛酸酶的影響，結果表明草莓渣有利于聚半乳糖醛酸的合成。BOTELLA C等[12]研究發現，葡萄渣可作為唯一營養物質以固態發酵方式合成聚半乳糖醛酸酶，結果表明聚半乳糖醛酸外切酶活性在發酵早期快速增長，隨培養時間延長而逐步降低，而聚半乳糖醛酸內切酶活性恰與之相反，且后者活性受培養基中還原糖分解代謝阻遏調節。MACIEL M等[13]以橙皮為支持物對黑曲霉URM 5162進行固定，探索用固定床反應器篩選聚半乳糖醛酸酶產生菌的方法。為提高聚半乳糖醛酸酶合成量，SOLIS-PEREIRA S等[14]研究黑曲霉采用固態發酵和液態深層發酵方式下，不同的碳源及各個碳源的不同濃度對聚半乳糖醛酸酶合成的影響，結果表明以果膠或聚半乳糖醛酸為誘導劑，可以促進聚半乳糖醛酸酶的合成，而較高濃度的葡萄糖會抑制聚半乳糖醛酸酶。

本研究的目的是確定黑曲霉18-23以固態發酵方式轉化不同食品加工廢棄物（葡萄渣、蘋果渣和柑橘渣）合成聚半乳糖醛酸的潛力，探索可溶性碳源對該酶的誘導作用，并測定溫度和pH值對該酶活性的影響。研究表明，具有工業應用潛力的聚半乳糖醛酸酶必須具備特定條件下的結構穩定性。這有助于酶高效穩定的發揮催化作用，擴大其應用領域。因此，本研究將為食品加工、酶工業及微生物學領域提供有益的參考信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

黑曲霉（A.niger）18-23：保存于江西農業大學應用微生物研究所；葡萄渣、蘋果渣、柑橘渣：從當地市場購買3種水果，經破碎榨汁后獲得。果渣在干燥箱中80 ℃烘至恒質量，粉碎機粉碎，過20目篩，備用。

1.1.2 化學試劑

葡萄糖、乳糖、半乳糖、硫酸銨、檸檬酸、硝酸、檸檬酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；槐糖（純度≥98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；聚半乳糖醛酸（純度≥90%）、半乳糖醛酸（純度≥95%）：美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：按照文獻[15]配制。

礦物質溶液：硫酸銨0.1%，硫酸鎂0.5%，磷酸二氫鉀0.5%，硫酸亞鐵0.000 5%，pH 5。

1.2 儀器與設備

DHG-9030A鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；FW-200高速萬能粉碎機：常州市華怡儀器制造有限公司；UV-1800紫外可見光分光光度計：日本島津公司；雷磁PHSJ-4A型pH計：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；H2500R-2高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；HWS-12水浴鍋：上海五相儀器儀表有限公司；LC-1260Ⅱ高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；YSD-8-13馬弗爐：上海姚氏儀器設備廠；LRH-250恒溫培養箱：廣東省醫療器械廠；LHS-250SC數顯恒溫恒濕培養箱：常州梅香儀器有限公司；BS-4G數顯振蕩培養箱：常州市國旺儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料化學分析檢測

為了解果渣中相關成分的組成及含量，將葡萄渣、蘋果渣、柑橘渣粉碎烘干后進行以下測定：

灰分、木質素含量：按照文獻[16]的方法測定；粗蛋白含量：按照文獻[17]的方法測定；果膠含量：按照文獻[18]的方法測定；纖維素和半纖維素含量：按照文獻[19]的方法測定；聚半乳糖醛酸酶活性：按照文獻[20]的方法測定。

1.3.2 種子液制備

黑曲霉孢子懸浮液制備：將黑曲霉18-23孢子以涂布方式接種到PDA培養基平板上，30 ℃避光培養7 d，用無菌水洗脫黑曲霉孢子，無菌脫脂棉過濾，收集濾液，將濾液收集在無菌離心管中，黑曲霉孢子濃度調整至1×107～2×107個/mL，4 ℃保存。

1.3.3 固態發酵

將粉碎烘干后的葡萄渣、蘋果渣、柑橘渣分別裝入不同的500 mL三角瓶中，20 g/瓶，用礦物質溶液將果渣含水量調節至60%，121 ℃滅菌30 min。待培養基冷卻至室溫后，接種黑曲霉18-23孢子懸浮液，接種量為80 mL/kg，攪拌均勻，置于恒溫恒濕培養箱30 ℃培養10 d，相對濕度維持在70%。每天攪拌1次，并取樣測定聚半乳糖醛酸酶的酶活力。

1.3.4 粗酶的提取及酶活力測定

在固態發酵培養物中取1 g樣品，加入25 mL 100 mmol/L pH4.8檸檬酸鹽緩沖溶液，室溫條件下200 r/min振蕩浸提1 h，浸提液真空抽濾，濾液4 ℃、9 000×g離心20 min，上清液4 ℃保存，用于聚半乳糖醛酸酶的酶活力測定。

聚半乳糖酸酶酶活定義：在測試條件下，每分鐘產生1 μmol半乳糖醛酸所需酶的數量為1個酶活力單位（U/mL）。固態發酵酶活力用每克干培養基中的U表示（U/g）。相對酶活性定義為聚半乳糖醛酸酶經過不同溫度或pH緩沖液處理后酶活力與最適條件酶活力比值×100%。

1.3.5 半乳糖醛酸標準曲線的繪制

用半乳糖醛酸配制標準溶液，按DNS法[21]測定各個標準溶液在波長540 nm處的吸光度值，分別以半乳糖醛酸含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制半乳糖醛酸標準曲線。

1.3.6 添加不同可溶性碳源對聚半乳糖醛酸酶合成影響

為測定不同可溶性碳源對聚半乳糖醛酸酶合成的影響，將葡萄糖、半乳糖、乳糖、槐糖4種可溶性碳源分別添加到柑橘渣固態基質中。其中低濃度組的添加量為0.5%，高濃度組的添加量為1.0%，以不添加可溶性碳源固態基質為對照（CK）。用礦物質溶液將果渣含水量調節至60%，121 ℃滅菌30 min。冷卻后，按80 mL/kg接種黑曲霉18-23孢子懸浮液，攪拌均勻，置于30 ℃固態發酵8 d，相對濕度維持在70%左右。每天攪拌1次，并取樣測定聚半乳糖醛酸酶的酶活力。

1.3.7 溫度對聚半乳糖醛酸酶活力和穩定性的影響

分別在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃溫度條件下，保溫酶液與1%聚半乳糖醛酸底物反應混合物（pH 4.8）20 min，測定聚半乳糖醛酸酶活力，確定聚半乳糖醛酸酶的最適溫度。粗酶液在40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃溫度條件下，水浴保溫30 min和60 min后，測定聚半乳糖醛酸酶粗酶液熱穩定性，并計算相對酶活。

1.3.8 pH值對聚半乳糖醛酸酶活力和穩定性的影響

測定pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0條件下聚半乳糖醛酸酶活力，確定聚半乳糖醛酸酶的最適pH。粗酶液在不同pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的緩沖液于30 ℃水浴保溫2 h，測定聚半乳糖醛酸酶pH穩定性并計算相對酶活。

1.3.9 數據處理

所有樣品一式3份，結果用均數±標準差表示。采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），并在5%的顯著水平上進行Tukey檢驗，采用Origin8.5作圖。

2 結果與分析

2.1 原料化學成分分析

三種果渣化學成分檢測結果見表1。

表1 3種果渣化學成分分析結果Table 1 Analysis results of chemical compositions of three kinds of pomaces

由表1可知，葡萄渣、蘋果渣和柑橘渣的化學組成中，灰分、粗蛋白、果膠、木質素、纖維素、半纖維素含量差異顯著（P＜0.05）。葡萄渣的粗蛋白含量為（11.1±0.1）g/100 g，顯著高于蘋果渣（4.6±0.3）g/100 g和柑橘渣（8.1±0.2）g/100 g（P＜0.05）；而蘋果渣和柑橘渣的纖維素含量接近，分別為（15.3±0.2）g/100 g和（16.9±0.4）g/100 g，顯著高于葡萄渣（P＜0.05）。葡萄渣木質素含量最高為（38.7±0.4）g/100 g，其次為蘋果渣（15.2±0.3）g/100 g，而柑橘渣最低（1.1±0.1）g/100 g。柑橘渣的半纖維素含量最高為（12.4±0.2）g/100 g，而葡萄渣和蘋果渣含量接近，分別為（4.5±0.2）g/100 g和（4.7±0.1）g/100 g。果渣中的纖維素、半纖維素可為微生物的生長提供良好的碳源，而木質素含量高會阻礙微生物接觸纖維素和半纖維素，影響誘導水解酶的分泌而導致微生物生長緩慢[22]。從原料分析結果來看，柑橘渣的果膠、纖維素和半纖維含量最高，有利于促進微生物的生長及果膠酶的產生。

2.2 固態發酵底物對聚半乳糖醛酸酶合成的影響

黑曲霉18-23能夠在葡萄渣、蘋果渣、柑橘渣培養基中生長，在葡萄渣、蘋果渣、柑橘渣培養基上，黑曲霉18-23固態發酵過程中產胞外聚半乳糖醛酸酶情況見圖1。由圖1可知，酶活性隨著培養時間的延長不斷增加，增速初期較緩，中后期增速較快，發酵8 d時達到最高，繼續培養，酶活力下降。三種培養基中的聚半乳糖醛酸酶產量不同，柑橘渣中酶產量最高，其次是蘋果渣。與柑橘渣和蘋果渣相比，葡萄渣不適合聚半乳糖醛酸酶的合成。以柑橘渣和蘋果渣為發酵培養基所產酶活力分別為56.9U/g和42.1 U/g，分別是以葡萄渣為培養基所得酶活力的2.3倍和1.7倍。三種果渣中，柑橘渣和蘋果渣的果膠相對含量較高（見表1），在發酵過程中能夠誘導更多的果膠酶的產生。因此，后續選擇柑橘渣培養基發酵產聚半乳糖醛酸酶。

圖1 不同果渣底物對黑曲霉18-23產聚半乳糖醛酸酶的影響Fig.1 Effect of different pomace substrates on polygalacturonase production by Aspergillus niger 18-23

2.3 可溶性碳源對聚半乳糖醛酸酶合成的影響

在柑橘渣中添加不同濃度、不同種類碳源，接種黑曲霉固態發酵8 d，所產聚半乳糖醛酸酶活力結果見圖2。由圖2可知，葡萄糖對聚半乳糖醛酸酶的形成起到顯著抑制作用，隨著葡萄糖濃度從0.5%提高到1.0%，聚半乳糖醛酸酶活力從16.2 U/g降低到10.3 U/g，均顯著低于對照酶活力（53.6 U/g）（P＜0.05）。與之相反，柑橘渣培養基中添加1.0%乳糖后，聚半乳糖醛酸酶酶活力達到66.6 U/g，比對照顯著增加（P＜0.05）。而添加半乳糖或槐糖對聚半乳糖醛酸酶的合成并沒有促進作用。乳糖由一個半乳糖和一個葡萄糖構成，葡萄糖是單糖，極易被微生物細胞利用，它的進入會抑制細胞中誘導酶基因的表達，進而降低相應蛋白酶的合成。葡萄糖或半乳糖的添加量與聚半乳糖醛酸酶合成呈負相關，乳糖主要發揮誘導作用導致聚半乳糖醛酸酶酶活力增加，而槐糖無誘導作用。

圖2 不同碳源添加量對黑曲霉18-23發酵柑橘渣產聚半乳糖醛酸酶的影響Fig.2 Effect of different carbon source addition on polygalacturonase production from citrus pomace by Aspergillus niger 18-23

2.4 溫度對聚半乳糖醛酸酶活力和穩定性的影響

溫度對黑曲霉18-23以柑橘渣固態發酵所得的聚半乳糖醛酸酶酶活及熱穩定性的影響結果見圖3。

圖3 溫度對黑曲霉18-23所產聚半乳糖醛酸酶的酶活（A）及熱穩定性（B）的影響Fig.3 Effect of temperature on the enzyme activity (A) and thermal stability (B) of polygalacturonase produced by Aspergillus niger 18-23

由圖3A可知，當溫度在20～50 ℃范圍內升高，聚半乳糖醛酸酶粗酶酶活力隨之增大；當溫度為50 ℃，酶活最大，為56.3 U/g；當溫度達到60 ℃時，酶活力為41.2 U/g，仍然保持73%的酶活力；當溫度超過60 ℃之后，酶活力大幅下降，當溫度為80 ℃時，聚半乳糖醛酸酶粗酶喪失酶活性。因此，聚半乳糖醛酸酶最適溫度為50 ℃。

由圖3B可知，聚半乳糖醛酸酶在40℃和45℃保溫30 min和60 min都具有良好的穩定性，相對酶活力均＞92%。在酶活最適溫度50 ℃條件下保溫30 min，聚半乳糖醛酸酶的熱穩定性良好，酶的殘留活性為97%，而當保溫60 min時，相對酶活力降低約20%。55 ℃條件下保溫30 min和60 min，殘留活性分別為64%和42%。而當溫度超過60 ℃之后，酶的殘留活性急劇降低，保溫60 min后，相對酶活力僅為10%。因此，聚半乳糖醛酸酶在溫度40～50 ℃范圍熱穩定性良好。

2.5 pH對聚半乳糖醛酸酶活力和穩定性的影響

pH值對黑曲霉18-23所產聚半乳糖醛酸酶酶活及pH穩定性影響結果見圖4。

圖4 pH值對黑曲霉18-23所產聚半乳糖醛酸酶的酶活（A）及pH穩定性（B）的影響Fig.4 Effect of pH value on the enzyme activity (A) and pH stability(B)of polygalacturonase produced by Aspergillus niger 18-23

由圖4A可知，聚半乳糖醛酸酶在酸性范圍能夠維持較好的酶活力，當pH值在4.0～6.0范圍內，酶活力高于39.3 U/g；當pH值為5.5時，酶活力最大，為52.3 U/g；當pH值從4.0降至3.0時，酶活力有所降低；而當pH值＞6.5之后，酶活力顯著降低（P＜0.05）。因此，聚半乳糖醛酸酶最適pH值為5.5。

由圖4B可知，聚半乳糖醛酸酶在pH 4.0～5.5范圍之間，相對酶活力在95%以上；在pH 3.5和6.0，相對酶活力分別為80.5%和73.8%；當pH值＞7.0之后，相對酶活力喪失50%以上。因此，聚半乳糖醛酸酶在pH4.0～5.5范圍穩定性良好。

3 結論

黑曲霉18-23具有以葡萄渣、蘋果渣和柑橘渣為底物固態發酵生產聚半乳糖醛酸酶的潛力，固態發酵可降低該酶的生產成本。3種底物中柑橘渣為最適底物，其酶活力達到56.9 U/g，為葡萄渣所產酶活力的2.3倍。

乳糖能夠誘導聚半乳糖醛酸酶的產生，酶活力達到66.6 U/g，比對照約提高24%，而槐糖、半乳糖對該酶產生無顯著作用，葡萄糖能夠抑制該酶的合成。

黑曲霉18-23所產聚半乳糖醛酸酶的粗酶最適溫度為50 ℃，最適pH值為5.5，且在溫度40～50 ℃、pH 4.0～5.5穩定性良好，具有廣闊的推廣應用前景。