發酵紅樹莓汁乳酸菌的篩選及抗氧化活性研究

王 惠，趙國群，馮鳳琴

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊 050018；2.浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江杭州 310058）

乳酸菌是一類能利用可發酵碳水化合物產生大量乳酸的細菌的通稱[1]。乳酸菌具有改善胃腸道、降低膽固醇、增強免疫力以及抗氧化等多種生理功能，已廣泛應用于食品工業，是公認的益生菌[2]。益生菌發酵果蔬汁是近年來功能性食品研究的熱點之一。益生菌發酵不僅能夠增加果蔬汁有機酸、香氣物質的種類，改善風味，而且還能夠提高降血糖、抗氧化等保健功效。任婷婷等[3]用混合乳酸菌發酵蘋果漿，發現發酵后酯類、醇類和酮類揮發性風味物質含量增加，蘋果漿風味顯著改善。FILANNINO P等[4]用乳酸菌發酵櫻桃汁，研究發酵前后酚類物質的變化，發現一些大分子的酚類物質被分解轉化為小分子的酚類物質，提高了生物利用度。ANKOLEKAR C等[5]研究發現，通過乳酸菌發酵可提高梨汁的降血糖和降血壓性能。

樹莓（Rubus corchorifoliusL.）又名山拋子、覆盆子和托盤等，為薔薇科懸鉤子屬灌木型植物。樹莓果實甘爽多汁，含有豐富的鞣花酸、黃酮和水楊酸等多種生物活性成分[6]。樹莓成熟后極易腐爛，不耐貯運，目前大部分樹莓果實都用于加工樹莓汁、樹莓醬、樹莓酒等食品[7]。隨著人們生活水平的提高和保健意識的增強，非常有必要進一步開發功能性樹莓加工產品。常曼曼等[8]采用保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）發酵紅樹莓汁，發現乳酸菌發酵能產生愉悅的風味物質，使口感柔和爽口，但總酚含量和總黃酮含量顯著下降。樹莓汁的乳酸菌發酵研究的總體相對較少，目前尚沒有適于樹莓汁發酵的專用乳酸菌菌種。影響果蔬汁乳酸發酵質量的因素包括果蔬品種、成熟度、發酵菌種、發酵工藝等，選擇能適應果蔬汁發酵條件且風味優良的乳酸菌種尤為關鍵。

本研究從抗氧化活性、胃腸道環境耐受性、抑菌性能及菌體生長能力四個方面對12株乳酸菌進行評價篩選，從中篩選出優良乳酸菌株；并采用優選菌株發酵紅樹莓汁，以期為功能性發酵樹莓汁飲料的產業化開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及原材料

短桿菌（Lactobacillus brevis）S1、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）W1、SL、LGG、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）YSHM3、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）W3、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）YN4、YJ1、YJ4、YJ10、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）T34、Lactobacillus acidipiscis（YJ5）：浙江大學食品營養健康益生菌菌種保藏庫；冷凍紅樹莓（品種：哈瑞太茲）：上海禪蓮生物科技有限公司；人工胃液：北京索萊寶科技有限公司；人工小腸液：上海源葉生物科技有限公司；。

1.1.2 化學試劑

總抗氧化能力檢測試劑盒（（2,2'-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS））、總抗氧化能力檢測試劑盒（（鐵離子還原/抗氧化能力（Ferric ion reducing antioxidant power，FRAP））：碧云天生物技術研究所；果膠酶（酶活50 000 U/g）：寧夏和氏璧生物技術有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美國Sigma公司；1,10-鄰菲羅啉（純度＞98%）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

MRS、LB培養基：廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

L18-Y928S破壁機：九陽股份有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；M200PRO酶標儀：瑞士Tecan公司；LRH-25OF生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；PHSJ-4F pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；FS-250超聲處理器：上海生析超聲儀器有限公司。1100型高效液相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵紅樹莓汁的加工工藝及操作要點

冷凍樹莓→解凍→打漿→酶解→調糖→滅菌→接種→發酵→發酵紅樹莓汁

操作要點：

解凍、打漿：冷凍紅樹莓果實在室溫條件下自然解凍，用破壁機打漿。

酶解：紅樹莓打漿后加入2%果膠酶，40 ℃水浴中酶解3 h，2層紗布過濾，得到紅樹莓汁。

成分調整：加入白砂糖調節其糖度至16.5°Bx。

滅菌：85 ℃條件下滅菌20 min，保存備用。

乳酸菌的活化：將保存的乳酸菌株接種于MRS液體培養基，37 ℃厭氧培養24 h?；罨蟮娜樗峋糜? ℃冰箱保存備用。

接種：按4%的接種量接入活化后的乳酸菌。

發酵：在37 ℃條件下進行厭氧發酵，定時取樣測定活菌數，當活菌數不再增加時，終止發酵。

1.3.2 無菌體發酵液和菌懸液的制備

將乳酸菌活化后接種于MRS液體培養基，37 ℃厭氧培養48 h，培養液在8 000 r/min條件下離心5 min，將菌體和上清液分離。收集的菌體用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌2次，然后再將菌體用無菌PBS制成菌懸液，并調整菌懸液OD600nm值=1。上清液用0.22 μm的無菌濾膜過濾，即得無菌體發酵液，置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.3 抗氧化活性測定

（1）清除DPPH自由基能力的測定[9]

吸取0.5 mL樣品，加入0.5 mmol/L的DPPH-乙醇溶液0.5 mL，室溫避光條件下靜置反應30 min后，5 000 r/min離心10 min，取上清液在波長517 nm處，測其吸光度值。對照組將樣品換為無菌PBS溶液，空白組將DPPH-乙醇溶液換為乙醇溶液。DPPH自由基清除率的計算公式如下：

式中：A為樣品組吸光度值；Ai為空白組吸光度值；A0為對照組的吸光度值。

（2）清除羥基自由基能力的測定[10]

吸取0.5 mL 2.5 mmol/L的1，10-鄰菲羅啉加入1.0 mL的PBS緩沖液中，混勻，向混合液中加入0.5 mL 2.5 mmol/L的硫酸亞鐵，混勻，加入0.5 mL 2.5 mmol/L的過氧化氫，混勻，最后加入0.5 mmol/L的處理后的樣品，混勻后置于37 ℃條件下，反應2 h。其中對照組將樣品換成等量的蒸餾水，空白組將過氧化氫和樣品都換成等量的蒸餾水。反應完成后，8 000 r/min離心10 min，取上清液，在波長536 nm條件下測定OD536nm值。羥基自由基清除率的計算公式如下：

（3）ABTS法測定總抗氧化能力

按照試劑盒要求配制ABTS工作液和測定操作。利用試劑盒中的Trolox標準品得到標準曲線，根據標準曲線回歸方程計算出樣品的ABTS 總抗氧化能力。

（4）FRAP法測定總抗氧化能力

按照試劑盒要求配制FRAP工作液和測定操作。利用試劑盒中的FeSO4標準品得到標準曲線，根據標準曲線回歸方程計算出樣品的FRAP總抗氧化能力。

1.3.4 胃腸道環境耐受性的測定

參考趙芳等[11]的方法，采用模擬胃腸道環境測定乳酸菌株的耐受性。將活化好的乳酸菌在8 000 r/min條件下離心5 min，棄上清液，用無菌PBS洗滌菌體2次，再用PBS重懸菌體至原來體積。取0.5 mL菌懸液加入4.5 mL人工胃液，于37 ℃厭氧培養，分別在0 h、3 h時，取樣采用平板稀釋法[12]測定其活菌數。然后，吸取0.5 mL處理3 h的含菌人工胃液與4.5 mL人工腸液混合，繼續于37 ℃厭氧靜置培養，在8 h時取樣測定其活菌數，計算存活率。

1.3.5 抑菌性能的測定

使用瓊脂孔擴散法測定乳酸菌株的抑菌性能[13]。取20 mL滅菌冷卻至45 ℃的LB固體培養基分別與1 mL大腸桿菌（Escherichia coli）、金色葡萄球菌菌液（Staphylococcus aureus）（105～106CFU/mL）一起倒入平板混勻，待凝固后于平板上打孔，孔徑為8 mm。將已制備好的無菌上清液（將培養好的乳酸菌液離心，上清液用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，置于-80 ℃保存）100 μL加入孔中，以等體積已滅菌的MRS培養基為對照，置于4 ℃冰箱中擴散12 h，取出放入37 ℃生化培養箱培養24 h，測量其抑菌圈直徑。

1.3.6 分析檢測

總黃酮的測定采用NaNO2-Al（NO2）3-NaOH比色法[14]、總酚含量的測定采用福林酚法[15]、總酸的測定采用酸堿滴定法[16]、有機酸的測定采用高效液相色譜法[17]。

1.3.7 統計分析

每個試驗重復3 次，采用SPSS 17.0 統計軟件對數據進行處理，試驗結果以均值±標準偏差（Mean+SD）表示。

2 結果與分析

2.1 優良乳酸菌株的篩選

2.1.1 不同菌株菌懸液及發酵液的抗氧化活性

乳酸菌具有抗氧化作用，但菌株之間的抗氧化活性具有較大的差異[18-19]。由表1可知，同一株菌的不同組分的DPPH自由基清除能力不同，無菌體發酵液的DPPH自由基清除能力優于細胞菌懸液，這一結果與林祥娜等[19]的研究結果一致。12株乳酸菌無菌體發酵液均具有較好的清除DPPH自由基能力，其清除能力在59.98%～71.23%之間，其中清除能力較強的依次為菌株YJ5＞菌株YJ1＞菌株SL，而菌株YN4的清除能力最弱；12株乳酸菌細胞菌懸液的清除DPPH自由基能力較弱，其清除能力在9.02%～13.53%之間，其中清除能力較強的依次為菌株YJ1＞菌株YN4＞菌株W3，而菌株W1的清除能力最弱。

由表2可知，細胞菌懸液的羥基自由基清除能力強于無菌體發酵液。12株乳酸菌的細胞菌懸液均具有較強的清除羥基自由基能力，但菌株之間的清除能力有顯著的差異。細胞菌懸液羥基自由基清除能力最強的為菌株T34，其次是菌株YJ1和菌株YJ5，而菌株SL清除能力最弱；12株乳酸菌無菌體發酵液的清除羥基自由基能力較弱，且菌株之間的差異較小，其中清除能力較強的依次為菌株YJ1＞菌株YN4＞菌株YJ10。

表1 不同乳酸菌菌株菌懸液及發酵液的DPPH自由基清除能力Table 1 DPPH free radical scavenging capacity of suspension and fermentation broth of different lactic acid bacteria

表2 不同乳酸菌菌株菌懸液及發酵液的羥基自由基清除能力Table 2 Hydroxyl free radical scavenging capacity of suspension and fermentation broth of different lactic acid bacteria

2.1.2 模擬胃腸道環境耐受性

益生菌被攝入人體后，在人體腸道中存活和定殖能力的強弱直接決定著其是否能發揮益生作用，因此耐胃酸、腸液等特性是優良乳酸菌作為益生菌的一個重要指標[11]。由表3可知，不同乳酸菌株對人工胃液、人工腸液的耐受性有很大的差異。菌株SL對胃腸道環境具有良好的耐受性，經過胃腸液處理后其細胞存活率達73.43%，而菌株YN4對胃腸道環境耐受性很差，其細胞存活率僅為15.71%。在所試驗的12株乳酸菌中，對胃腸道環境耐受性最好的三株菌依次是SL、YJ1和T34。

表3 不同乳酸菌菌株模擬胃腸道環境耐受性Table 3 Tolerance of different lactic acid bacteria to simulated gastrointestinal environment

2.1.3 抑菌性能

由表4可知，12株乳酸菌均對大腸桿菌、金色葡萄球菌具有顯著的抑制作用（P＜0.05），其中對金色葡萄球菌的抑菌性能好于對大腸桿菌，同一菌株對金色葡萄球菌的抑菌圈直徑均大于對大腸桿菌的抑菌圈直徑。對于抑制大腸桿菌而言，抑菌性能最好的依次為菌株YJ10＞菌株YJ1＞菌株SL，而對于抑制金色葡萄球菌而言，菌株YJ1的抑菌圈直徑最大（26.85 mm），其次是菌株W1（25.57 mm）和菌株YN4（25.44 mm）。菌株YJ1對大腸桿菌和金色葡萄球菌均表現出良好的抑菌性能，其抑菌圈直徑分別達到17.46 mm和26.85 mm。

表4 不同乳酸菌菌株的抑菌活性Table 4 Antibacterial activity of different lactic acid bacteria

2.1.4 樹莓汁中的生長能力

根據上述試驗結果，從抗氧化活性、胃腸道環境耐受性和抑菌性能三個指標綜合考慮，12株乳酸菌中綜合性能最好的為菌株YJ1，菌株SL、YJ5、YJ10 和T34綜合性能也較好。除了具有良好的抗氧化活性、胃腸道環境耐受性和抑菌性能外，在發酵紅樹莓汁時，還要求乳酸菌能在高酸度的紅樹莓汁中良好生長。由圖1可知，菌株YJ1、SL、T34、YJ5和YJ10均可在紅樹莓汁中良好生長，其中生長最好的是菌株YJ1，發酵36 h時活菌數達到最大值，9.45 lg CFU/mL；YJ10生長得相對較差，發酵48 h時活菌數達到最大值，8.55 lg CFU/mL。綜合上述試驗結果，選擇副干酪乳桿菌YJ1為最佳的紅樹莓汁乳酸菌發酵菌株。

圖1 不同乳酸菌株在紅樹莓汁中的生長能力Fig.1 Growth capacity of lactic acid bacteria in red raspberry juice

2.2 發酵前后紅樹莓汁成分的變化

按4%接種量將副干酪乳桿菌YJ1接入紅樹莓汁中，37℃厭氧發酵60 h。發酵結束后，測定發酵紅樹莓汁的總黃酮、總酚、可滴定酸和有機酸含量，結果見表5。

由表5可知，經過乳酸菌發酵，樹莓汁中總黃酮和總酚含量都有了極顯著的增加（P＜0.01），其中總黃酮含量增加了23%，總酚含量增加了18.58%，這與冉玉兵等[20]的結果一致，其原因可能與發酵過程中乳酸菌的生物降解作用或酸水解反應將聚合酚類物質轉化成更多簡單酚類物質有關，或可能由于發酵過程中產生的微生物酶類（如葡糖甘酶、淀粉酶），分解植物細胞壁或淀粉，進而促進了多酚類物質的釋放；然而，常曼曼等[8]發現，與紅樹莓原汁相比，乳酸菌發酵后的樹莓汁總酚含量和總黃酮含量顯著下降，其原因可能與使用的原料及乳酸菌種有關。從表5還可發現，與發酵前的紅樹莓原汁相比，發酵后的樹莓汁總酸極顯著增加（P＜0.01），這是由于乳酸菌在樹莓汁中生長產酸的緣故。紅樹莓果實的主要有機酸為檸檬酸、蘋果酸、富馬酸等。經過乳酸菌發酵，檸檬酸和蘋果酸含量減少，特別是檸檬酸含量降低了35.54%，而乳酸、乙酸、酒石酸和富馬酸含量增加，其中乳酸含量的增加量最大，達到了27.04 g/L。乳酸的酸味柔和，有后酸味，乳酸含量的增加使得紅樹莓汁口感更加柔和。

表5 發酵前后紅樹莓汁成分對比Table 5 Comparison of components in red raspberry juice before and after fermentation

2.3 發酵紅樹莓汁的抗氧化活性

將副干酪乳桿菌YJ1接入紅樹莓汁中，37 ℃厭氧發酵60 h，發酵結束后測定紅樹莓汁的抗氧化活性，結果見表6。由表6可知，與未發酵的紅樹莓汁相比，發酵后紅樹莓汁清除DPPH、羥基自由基的能力有了明顯改善，其DPPH清除能力提高了22.92%，羥基自由基清除能力提高了15.63%。發酵后紅樹莓汁ABTS總抗氧化能力從23.27 mmol/L增加至31.72 mmol/L，增加了36.31%；發酵后紅樹莓汁FRAP總抗氧化能力從18.92 mmol/L增加至26.39 mmol/L，增加了39.48%。結果表明，乳酸菌發酵提高了紅樹莓汁的抗氧化活性。造成這種結果的原因，可能與乳酸菌發酵后樹莓汁中總黃酮和總酚含量顯著增加（見表5）有關。

表6 發酵紅樹莓汁的抗氧化活性Table 6 Antioxidant activity of fermented red raspberry juice

3 結論

從抗氧化活性、胃腸道環境耐受性、抑菌性能及紅樹莓汁中生長能力四個方面對12株乳酸菌進行了綜合評價篩選，從中篩選出1株優良乳酸菌株，即副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）YJ1。采用副干酪乳桿菌YJ1發酵紅樹莓汁，發現經過乳酸菌發酵的紅樹莓汁中總黃酮、總酚含量分別增加了23%、18.58%。發酵后紅樹莓汁總酸也極顯著增加（P＜0.01），其中增加的有機酸主要是乳酸。與未發酵的紅樹莓原汁相比，發酵后的紅樹莓汁體外抗氧化活性顯著提高（P＜0.01），其DPPH和羥基自由基清除能力分別提高了22.92%、15.63%；ABTS和FRAP總抗氧化能力分別增加了36.31%、39.48%。結果表明，乳酸菌發酵紅樹莓汁具有一定的抗氧化活性。