綠衣觀音土曲培養過程中微生物及酶系的動態變化

唐 潔，陳申習，張 磊，張 龍，楊 強

（勁牌有限公司勁牌研究院中藥保健食品質量與安全湖北省重點實驗室，湖北大冶 435100）

白酒發酵是一個獨特復雜的邊糖化和邊發酵過程，而酒曲是白酒釀造必不可少的糖化、發酵和生香劑[1]。傳統的酒曲制作是一種在開放環境中自然固態發酵過程，可以從環境和原料中富集、網絡各種微生物形成復雜的微生物菌群，同時產生重要的酶類（如淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等），并且酒曲中所網羅的菌種豐度、協調性及在制曲過程形成的風味前驅物質，是酒體質量和產量的重要保障[2-5]。因此，酒曲成為釀酒品控的核心指標之一。酒曲根據培養達到的頂溫可分為低溫酒曲（40～50 ℃）、中溫酒曲（50～60 ℃）和高溫酒曲（60～70 ℃）；根據產酒的風味主要分為清香、濃香和醬香型酒曲；根據形狀可分為大曲、小曲和麩曲[6]。綠衣觀音土曲（簡介土曲）又名“綠衣小曲”、“綠曲”、“南曲”，是清香型白酒小曲曲種之一，被廣泛應用在湖北、湖南、江西等地[7]。綠衣觀音土曲是以觀音土、米粉、米糠為主要原料，接入曲種通過加水拌料，制成坯，入箱進行微生物培育，開箱后轉入培養室進行一至七燒共7輪培養，然后烘干而成。

近幾年，關于酒曲微生物多樣性、風味特征方面的研究較多。YAN S B等[8]研究發現，濃香型酒曲中含有14個種屬的酵母和43種風味物質，且優勢菌為庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）和Saturnispora silvae；ZOU W等[9]綜述了濃香型酒曲微生物多樣性，闡明了細菌類芽孢菌屬（Bacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）是優勢菌，酵母菌主要有酵母屬（Saccharomyces）、復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、畢赤酵母屬（Pichia）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、絲孢酵母屬（Trichosporon）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）和鎖擲酵母屬（Sporidiobolus），霉菌主要有曲霉屬（Aspergillus）、橫梗霉屬（Lichtheimia）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、熱子囊菌屬（Thermoascus）、犁頭霉屬（Absidia）和地霉屬（Geotrichum）；JIN Y等[10]研究發現，醬香型大曲中芽孢桿菌目（Bacillales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）和乳桿菌目（Lactobacillales）是優勢細菌，而真菌中假絲酵母屬（Candida）、木霉屬（Trichoderma）、曲霉屬（Aspergillus）、絲孢酵母屬（Trichosporon）和嗜熱真菌屬（Thermomyces）占主導地位，且建立了醬香型酒曲微生物代謝圖譜；FAN G S等[11]研究發現，老化有助于豐富和穩定清香型大曲中的微生物種群，使微生物之間的相互作用重新平衡，對提高大曲質量和確保其穩定性具有重要意義；LIU J J等[6]研究表明，中低溫大曲如濃香型和清香型酒曲中淀粉酶活性和多樣性最高，蛋白酶在高溫大曲如醬香型酒曲中起主導作用，而酯酶對濃香酒曲和醬香酒曲風味的貢獻度相似；申孟林等[12]概述了大曲微生物分類以及大曲中主要酶系的功能及作用。

目前的研究主要集中于對大曲微生物、酶活、風味物質的研究，而對清香型小曲研究較少，特別是對制曲過程中微生物及酶活的動態變化研究甚少。本研究選取8個批次觀音土曲培養過程為研究對象，了解制曲過程中（包括從曲種到成品曲出庫）微生物的種類、數量、消長變化及相關酶活（糖化酶、α-淀粉酶和酸性蛋白酶）變化，為監控觀音土曲質量、減少酒曲質量的波動，提供更深層次、更本質的指標。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

綠衣觀音土曲樣品由勁牌有限公司傳統模式制曲車間提供，分別于2018年9月、10月和11月對綠衣觀音土曲培養過程中（曲種、入箱、一燒、二燒、三燒、四燒、五燒、六燒和七燒）樣品進行采集，共采集8個批次，分別為0921、0927、1011、1019、1027、1103、1111、1122批次。

1.1.2 主要試劑

蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、瓊脂粉（均為生化試劑）、吐溫20、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、檸檬酸二胺、乙二胺四乙酸、乙酸、三羥甲基氨基甲烷（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂糖（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Mixer：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH自然，115 ℃滅菌15 min。

改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基[7]：在原有PDA培養基中添加牛肉膏2 g/L，酵母粉2 g/L，磷酸二氫鉀2.5 g/L，吐溫20 1.5 g/L，121 ℃滅菌20 min。

WL營養瓊脂培養基[7]：儲液A（磷酸二氫鉀5.5 g，氯化鉀4.25 g，氯化鈣1.25 g，硫酸鎂1.25 g，蒸餾水定容至400 mL）40 mL/L、儲液B（氯化鐵0.25 g，硫酸錳0.25 g，蒸餾水定容至100 mL）1 mL/L、儲液C（0.44 g溴甲酚綠溶于10 mL蒸餾水和10 mL酒精中）1 mL/L、酵母浸粉40 g/L，蛋白胨50 g/L，葡萄糖50 g/L，瓊脂2 g/L，pH 6.5，115 ℃滅菌15 min。

MRS培養基：蛋白胨10g/L，牛肉浸膏10g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖5 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸二胺2 g/L，吐溫80 1 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，七水硫酸錳0.05 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，瓊脂20 g/L，pH 6.8，121 ℃滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉浸膏3.0 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5.0 g/L，瓊脂20 g/L，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

孟加拉紅培養基：蛋白胨5 g/L，葡萄糖10 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，孟加拉紅0.033 g/L，瓊脂20 g/L，氯霉素0.1 g/L，121 ℃滅菌20 min。

察氏培養基：硝酸鈉3 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，氯化鉀0.5 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，蔗糖30 g/L，瓊脂20 g/L，121 ℃滅菌20 min。

其中YPD培養基、改良PDA培養基和WL營養瓊脂培養基分別添加5‰的青霉素，MRS培養基和牛肉膏蛋白胨培養基添加15‰鏈霉素。

1.2 儀器與設備

JJ1000電子天平：常熟雙杰測試儀器廠；QYC-200全溫空氣搖床：上海福瑪實驗設備有限公司；SFG-02B電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備儀器廠；AL204電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SPX-100B-Z生化培養箱：上海博訊實業有限公司；BCM-1600A潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；Nikon ECLIPSE E200LED MV Series顯微鏡：日本Nikon公司；2720聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國賽默飛公司；DYY-L電泳儀：北京六一生物科技有限公司；ZF-288全自動凝膠成像分析系統：上海嘉鵬科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 觀音土曲制作過程中微生物平板計數及分離純化

分別稱取觀音土曲培養過程中（曲種、入箱、一燒～七燒）樣品10 g于裝有100 mL無菌水的三角瓶中，150 r/min振蕩30 min后，吸取1 mL作梯度稀釋，選取合適的稀釋懸液涂布于計數培養基中，酵母總數計數采用YPD培養基，霉菌采用改良PDA培養基，細菌采用MRS培養基。涂布完畢后酵母和霉菌置于30 ℃培養箱中倒置培養3～5 d，細菌置于37 ℃培養箱中倒置培養2～3 d。采用菌落記號方式對培養基上長出的單菌落進行統計，根據菌落形態不同將平板上長出的單菌落劃線接種于新的培養基中培養，經過2～3次平板劃線后得到純化的菌落轉入相應的試管斜面于冰箱中保存。

1.3.2 菌株的鑒定

菌株的形態觀察和分子生物學鑒定方法見參考文獻[13]。

1.3.3 觀音土曲制作過程中酶活的測定

酸性蛋白酶酶活測定采用福林-酚法，具體方法見SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》；糖化酶酶活采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[14]；α-淀粉酶酶活采用Yoo改良法，具體見文獻[15]。

2 結果與分析

2.1 觀音土曲制作過程中微生物變化情況

2.1.1 酵母菌

觀音土曲制作過程中酵母菌菌落總數的變化見圖1。由圖1可知，觀音土曲制作過程中酵母菌落總數呈逐步上升趨勢，三燒過后酵母總數上升較快。經過富集培養，酵母總數由開始曲種的107CFU/g上升至四燒后的108CFU/g，且在五燒～七燒時數量達到峰值。不同批次四燒前酵母數量差別不明顯，四燒過后，11月份制作的觀音土曲中酵母總數高于9、10月份制作的觀音土曲。通過觀察酵母形態發現，曲種時以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為主，隨著酒曲的培養，從環境和原料中網羅和富集越來越多的非釀酒酵母（non-Saccharomyces），培養至二燒時非釀酒酵母的數量高于釀酒酵母。

圖1 不同批次綠衣觀音土曲制作過程中酵母菌總數的動態變化Fig.1 Dynamic change of total yeast count in the cultivation of different batches of Green-covering Guanyin Tuqu

采用不同的培養基（①YPD培養基；②鹽酸調YPD培養基pH至3.5，不滅菌，添加7%乙醇；③乳酸調YPD培養基pH至3.5，不滅菌；④WL營養瓊脂培養基）篩選觀音土曲制備過程中的酵母菌，根據菌落形態和顏色不同，共分離出8種不同種類的酵母，其菌落形態及描述見圖2及表1。

圖2 8株酵母菌的菌落形態Fig.2 Colony morphology of 8 strains of yeast

表1 8株酵母菌的菌落及細胞形態特征的描述Table 1 Description of colony and cell morphology characteristics of 8 strains of yeast

由圖2及表1可知，大部分酵母菌菌落呈圓形突起且顏色為白色，少數扁平，且表面不光滑的較多，有幾株酵母菌落較大。

8株分離的酵母菌株的系統發育樹見圖3，鑒定結果見表2。

圖3 基于18S rRNA序列8株酵母菌的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 8 strains of yeast based on 18S rRNA sequences

表2 8株酵母菌的鑒定結果Table 2 Identification results of 8 strains of yeast

由圖3及表2可知，分離的酵母菌主要是釀酒微生物，如釀酒酵母、異常威克漢姆酵母、庫德里阿茲威畢赤酵母等，這些是主要的釀酒酵母和生香酵母[16-18]，其中庫德里阿茲威畢赤酵母釀酒中的生香酵母，廣泛應用于發酵食品中，具有作為益生菌和代謝產生物乙醇的潛力[19-20]。溶磷白地霉廣泛應用于乳制品和酒精飲料行業中，同時也具有生物降解功能，也在醬香型白酒酒醅中分離過[21-22]。阿氏絲孢酵母普遍存在于低溫曲中，與釀酒酵母在高糖環境下混合發酵可有效降低酒中揮發性酸和乙醛的含量，同時該菌具有發酵產酯和產β-葡萄糖苷酶功能[20，23]。伯頓絲孢畢赤酵母則于高溫大曲中比較常見，具有淀粉酶活力和產香功能[24]。扣囊復膜孢酵母是大曲上霉的主要微生物，除高溫大曲中未發現外，均存在其余酒曲中，能夠表達生淀粉液化酶和糖化酶，被認為是產生淀粉分解酶類的最好的子囊酵母菌之一，同時具有產酯能力[1，25]。

2.1.2 霉菌

采用改良PDA培養基跟蹤綠衣觀音土曲制備過程中霉菌總數的變化見圖4。

圖4 不同批次綠衣觀音土曲制作過程中霉母菌總數的動態變化Fig.4 Dynamic change of total mold count in the cultivation of different batches of Green-covering Guanyin Tuqu

由圖4可知，霉菌的數量低于酵母和細菌，變化趨勢與酵母相近，不同批次三燒前霉母數量差別不明顯，三燒過后霉菌開始迅速增長，且11月份制作的觀音土曲中霉菌總數高于9、10月份制作的觀音土曲。通過形態觀察發現，米根霉在一燒和二燒時未檢測到，三燒過后數量明顯增加，曲種和七燒時米根霉數量為106CFU/g；曲霉在二燒時開始出現，數量在六燒或七燒時數量最多，為106CFU/g。

在改良PDA培養基分離的基礎上，進一步采用了YPD瓊脂培養基、孟加拉紅瓊脂培養基和察式培養基對綠衣觀音土曲制備過程中霉菌進行了分離純化，并根據霉菌菌落形態和顏色區別，共分離出7種不同種屬霉菌，其菌落形態及描述見圖5和表3，系統發育樹見圖6，鑒定結果見表3。

圖5 7株霉菌的菌落形態Fig.5 Colony morphology of 7 strains of mold

表3 7株霉菌菌落及細胞形態特征的描述Table 3 Description of colony and cell morphology characteristics of 7 strains of mold

圖6 基于ITS rRNA序列7株霉菌的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of 7 strains of mold based on ITS rRNA sequences

表4 7株霉菌的鑒定結果Table 4 Identification results of 7 strains of mold

由圖5、圖6及表3、表4可知，從綠衣觀音土曲中分離出的霉菌有曲霉屬、根霉屬、毛霉屬和橫梗霉屬，大多數種屬霉菌在其他香型白酒中均報道過[26-28]。其中，米根霉和棒曲霉是清香型小曲白酒優勢霉菌[7]。米根霉是主要的糖化微生物，具有較高的糖化力和液化力，能糖化淀粉、轉化蔗糖，產生乳酸、反丁烯二酸及微量酒精，產L（+）-乳酸能力強[7，13]，對白酒風味有貢獻作用[29]。棒曲霉同樣也具有一定的糖化酶和蛋白酶活性[7]。多枝橫梗霉具有高產酯酶活性，是中低溫大曲的優勢菌[30-31]。黃曲霉具有較強的液化力和蛋白分解力，可用于產生淀粉酶、蛋白酶和磷酸二酯酶等，也是釀造工業中的常見菌種[30]。煙曲霉是自然界中廣泛分布的人類條件致病菌，是導致侵染性曲霉病的主要原因，且產果膠酶分解纖維素等[32]。毛霉屬常出現在酒曲中，能糖化淀粉并能生成少量乙醇，產生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，我國多用來做豆腐乳、豆豉[33]。

2.1.3 細菌

綠衣觀音土曲制作過程中細菌總數的變化見圖7。

圖7 不同批次綠衣觀音土曲制作過程中細菌總數的動態變化Fig.7 Dynamic change of total bacteria count in the cultivation of different batches of Green-covering Guanyin Tuqu

由圖7可知，綠衣觀音土曲中的細菌總數呈先上升后下降的趨勢，峰值在一燒至三燒時出現，細菌數量為109CFU/g，七燒時細菌數量降至108CFU/g。入箱至三燒時數量增加最快，而此時期酵母數量變化緩慢。三燒過后，細菌數量下降，酵母數量開始明顯增加，這是由于兩大類微生物對營養物質的競爭所導致的。

采用牛肉膏蛋白胨培養基和MRS培養基從綠衣觀音土曲制備過程中分離純化出好氧細菌9株和乳酸菌5種，具體菌落形態及描述見圖8和表5，系統發育樹見圖9，鑒定結果見表6。

圖8 細菌的菌落形態Fig.8 Colony morphology of bacteria

表5 14株細菌菌落及細胞形態特征的描述Table 5 Description of colony and cell morphology characteristics of 14 strains of bacteria

圖9 基于16S rRNA序列細菌的系統發育樹Fig.9 Phylogenetic tree of bacteria based on 16S rRNA sequences

表6 14株細菌的鑒定結果Table 6 Identification results of 14 strains of bacteria

由圖8、圖9及表5、表6可知，分離獲得的細菌以芽孢桿菌和乳桿菌為主，其中芽孢桿菌是我國白酒釀造重要功能微生物，可水解蛋白質和淀粉等大分子物質，產丁酸及己酸等有機酸，有的還代謝產生吡嗪類等芳香物質，該屬細菌為白酒發酵過程中重要的產酸和產香菌。如地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌是醬香大曲重要的產醬香的功能細菌，可以產蛋白酶和風味物質[33-34]。而特基拉芽孢桿菌產蛋白酶，產β-1,3-1,4-葡聚糖酶[35-36]。類地衣芽孢桿菌產抗性活性物質，釀酒中產風味物質；可以分解氨基甲酸乙酯[37-38]。乳酸菌幾乎存在于所有的酒曲中，是白酒發酵中的主要生酸微生物，乳酸和乳酸乙酯是各種種類和香型的白酒必不可少的風味成分。同時有些種屬乳酸菌還可以代謝產生蘋果酸、雙乙酰等副產物，對白酒風格形成也有一定影響。因此，傳統研究認為乳酸菌是白酒釀造必不可缺少的微生物。其中瑞士乳桿菌具有較強的蛋白水解活性，其發酵乳制品中多肽含量較高，因此具有潛在產生生物活性肽的能力；具有緩解高血壓、維持腸道菌群平衡、促進鈣吸收、改善睡眠等功能，被用作保健品制成微生態制劑[39]。干酪乳桿菌作為益生菌之一被用作牛奶、酸乳、豆奶、奶油和干酪等乳制品的發酵劑及輔助發酵劑[39]，短乳桿菌具有高產酸能力和解毒、抑菌、提高機體免疫力等多種功能特性，廣泛應用于食品和醫藥行業[39]。還有些一些細菌，并沒有發現在釀造過程中的作用，可能是雜菌，如松鼠葡萄球菌和節桿菌是致病菌[40-43]，而雞葡萄球菌則屬于非致病菌[44]。嗜溫鞘氨醇桿菌產絮凝劑，降解石油[45-46]，可能這些菌來自環境中。

2.2 觀音土曲制作過程中酶活變化情況

在酒曲的制作以及貯存的過程中，大曲中的微生物會代謝產生一系列的水解酶，如酸性蛋白酶、糖化酶、纖維素酶等。這些水解酶會將原料中大分子物質降解成為小分子物質供微生物生長利用，從而產生一些代謝產物是白酒中香味物質或者為香味物質提供前體物質[47-48]。有研究表明，α-淀粉酶和蛋白酶主要是由細菌和霉菌產生，而糖化酶主要是由根霉、黑曲霉等霉菌產生[49-51]。綠衣觀音土曲制作過程中酶活變化情況見圖10。

圖10 不同批次綠衣觀音土曲制作過程中糖化酶（a）、α-淀粉酶（b）及酸性蛋白酶（c）酶活變化Fig.10 Changes of saccharifying enzyme (a),α-amylase (b) and acid proteinase activity (c) in the cultivation of different batches of Green-covering Guanyin Tuqu

由圖10可知，曲種糖化酶活力和α-淀粉酶活力最高，分別為3 000～6 000 U/g、300～600 U/g。分析原因可能是曲種作為綠衣觀音土曲生產的種子，其中含有一定比例強化的純種根霉。入箱培養后，糖化酶和α-淀粉酶呈逐漸上升的趨勢，均在五燒至七燒時酶活最高，七燒時糖化酶酶活為300～1 000 U/g，α-淀粉酶酶活為100～200 U/g。從微生物跟蹤檢測結果來看，曲種時米根霉數量最多，其次是五燒至七燒階段，而米根霉是產生糖化酶的主要微生物，這也是曲種的糖化酶酶活最高，五燒至七燒糖化酶酶活其次的原因。

相比糖化酶和α-淀粉酶，綠衣觀音土曲中酸性蛋白酶酶活較低，最高不超過50 U/g。曲種時酸性蛋白酶酶活最高，為10～50 U/g；入箱培養后，酸性蛋白酶酶活呈上升趨勢，六燒或七燒時酶活達到峰值，為5～50 U/g。有文獻報道，醬香型酒曲蛋白酶酶活最高，其次是濃香型酒曲，清香型酒曲酸性蛋白酶酶活最低[6]，說明酸性蛋白酶不是綠衣觀音土曲中主要的酶。

3 結論

綠衣觀音土曲制作培養過程中酵母總數呈逐步上升趨勢，三燒后酵母總數上升較快，且在五燒至七燒時數量達到峰值；細菌總數呈先上升和下降的趨勢，峰值在一燒至三燒時出現，數量為109CFU/g，七燒時細菌數量降至108CFU/g；霉菌的數量低于酵母和細菌。不同批次三燒前霉母數量差別不明顯，三燒過后霉菌開始迅速增長，在七燒時候達到最大（106CFU/g），且11月份制作的觀音土曲中霉菌總數高于9、10月份制作的觀音土曲。

通過形態觀察，共分離出8種酵母，經鑒定分別為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、阿氏絲孢酵母（Trichosporon asahii）、Apiotrichum loubieri、伯頓絲孢畢赤酵母（Hyphopichia burtonii）扣囊復膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和溶磷白地霉（Galactomyces geotrichum）；7種霉菌主要為曲霉屬（Aspergillus）、米根霉（Rhizopus oryzae）、毛霉（Mucor）和橫梗霉屬（Lichtheimia），其中米根霉是主要的糖化菌株；9種好氧細菌和5種乳酸菌，以芽孢桿菌和乳桿菌為主，分別是枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）、類地衣芽孢桿菌（Bacillus paralicheniformis）、雞葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum）和瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）等。

綠衣觀音土曲培養過程中糖化酶酶活最高，其次是α-淀粉酶，酸性蛋白酶酶活最低，且曲種中3種酶活力最高，入箱培養后3種酶活均呈整體上升趨勢。

本研究揭示了綠衣觀音土曲微生物及酶活的動態變化，為微生物及觀音土曲在白酒釀造中的功能作用解析及定向調控提供技術支撐，對提升清香型小曲白酒生產品質具有重要意義。