蒙古族奶嚼口與下層凝乳中乳酸菌的篩選和比較研究

徐偉良，李春冬，多拉娜，雅 梅，2，郭 梁，2*

（1.錫林郭勒職業學院生物工程研究院，內蒙古錫林浩特 026000；2.錫林郭勒職業學院食品檢驗檢測和風險評估中心，內蒙古錫林浩特 026000）

嚼口又名嚼克，蒙語稱“桌禾”，是蒙古族特色發酵奶油類食品中的一種。奶嚼口的傳統制作工藝是以牛奶自然發酵后漂浮在上層的乳白色脂肪為原料，經瀝乳清、攪打、低溫水洗、灌裝等工藝制成[1]。但由于其工序繁雜、耗時較多，隨著人民生活節奏的加快，傳統制作工藝接近失傳。現市場上所售賣的奶嚼口多為生產加工奶豆腐時的一種附屬產品。即在制作生產奶豆腐時，將新鮮牛奶不經過殺菌處理，直接過濾除雜后放入干凈容器中，靜置在蒙古包或室內的陰涼處自然發酵，發酵溫度在20 ℃左右，發酵時間夏季1～2 d，冬季3～4 d[2-4]。在發酵結束后，表層會出現一層成分多為乳脂的白色稠狀物質，即為奶嚼口，而下層即為用作奶豆腐制作前體的下層凝乳。

蒙古族傳統奶嚼口芳香濃郁，營養豐富是一種高油脂類乳制品。其口感略酸，食用時經常加一些白糖或拌炒米食用，是蒙古人招待賓客的上等食物。根據劉文麗等[5-6]對蒙古族傳統奶嚼口的理化和營養成分研究報道可知，其固形物平均含量為91.25%，還有多種人體必需的氨基酸、有機酸等風味物質和營養成分。但對傳統發酵奶嚼口發酵時，下層凝乳和奶嚼口之間營養成分和微生物組成的關系卻未見報道。目前，奶嚼口的生產仍處于傳統的手工作坊階段，自然發酵的開放狀態和制作工藝的操作對其安全性和品質有著非常不利的影響。另外，手工作坊式的生產技術使嚼口的制作難以標準化，這也是制約其產業化發展的技術瓶頸。

蒙古族發酵奶嚼口和下層凝乳利用自身環境中的微生物進行低溫自然發酵，不僅保留了乳品的天然品質特色，而且其中蘊藏著豐富的乳酸菌資源。但若想使乳酸菌在人體中發揮益生作用，必須經過消化道中低酸環境及高膽鹽環境的篩選，并能成功定植在腸道中才能發揮其功能。奶嚼口是鮮奶發酵后析出的一種高油脂類乳制品，而下層凝乳多為水分、蛋白質等組分，由于兩者間營養成分的不同，故推測兩者中乳酸菌的種類和數量也應存在著差異。本實驗通過對蒙古族發酵奶嚼口和下層凝乳中菌株進行分離、篩選、鑒定以及利用耐酸耐膽鹽實驗進行發酵性能比較研究，以期從中發掘優良發酵特性的乳酸菌資源，為蒙古族傳統奶嚼口和奶豆腐發酵菌劑的開發和進一步產業化生產應用提供有益借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品及原料來源

自然發酵奶嚼口和下層凝乳樣品均采自內蒙古錫林郭勒盟地區的牧民家中。純牛奶（蛋白質5%，脂肪6%，碳水化合物2%）：市售。

1.1.2 試劑及引物

兩性霉素B（2.5 mg/L）：美國Sigma公司；Code No.9164 Takara快速提取試劑盒：大連寶生物工程公司；EasyTaq聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Super Mix：北京全式金生物技術有限公司；細菌通用引物27F和1495R：由北京睿博生物科技有限公司合成。

1.1.3 培養基

MRS液體培養基、MRS固體培養基：北京路橋技術股份有限公司。

1.2 儀器與設備

HWS-250BX恒溫恒濕培養箱：天津泰斯特儀器有限公司；SW-J-2FD凈化工作臺：蘇州博萊爾凈化設備有限公司；Nanodrop 2000c核酸蛋白測定儀：美國Thermo Fisher公司；2720 Thermal Cycler PCR擴增儀：美國BIO-RAD公司；UV9100A紫外分光光度計：北京萊伯泰科儀器股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集

新鮮牛奶經錫林郭勒地區牧民家中低溫自然發酵3 d后，取上層奶嚼口及下層凝乳分別裝入無菌采樣袋中，并編號為XS-Z和XS-E，4 ℃條件下保存，盡快送回實驗室進行菌種分離。

1.3.2 樣品中乳酸菌的計數、分離和純化

樣品中乳酸菌計數參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》[7]。采取平板涂布法進行菌種分離。取1 mL新鮮采集的奶嚼口（編號XS-Z）和下層凝乳（編號XS-E）樣品加入9 mL含0.85%生理鹽水的試管內，進行連續梯度稀釋，選取3個適宜的梯度，于MRS平板培養基上進行涂布，將MRS平板倒置于37 ℃恒溫培養箱中，厭氧培養2～3 d。待觀察有菌落生長后，分別挑取100株單菌落于5 mL MRS液體培養基中進行連續純化培養2代。將菌落進行革蘭氏染色、鏡檢。將經過檢驗的革蘭氏陽性菌用30%甘油進行凍存，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3.3 菌株產酸凝乳能力篩選

將菌株取出復蘇后，用MRS液體培養基連續活化3代，按2%（V/V）接種量接種至純牛乳中，于37 ℃條件下培養，并以最終發酵8 h時的酸度（吉爾涅爾度，°T）、pH及凝乳狀態（是否凝乳、凝塊的顏色、風味，是否均勻、潤滑，有無龜裂及乳清分離等現象）作為篩選標準，進行產酸凝乳菌株的篩選。用pH酸度計直接測定發酵上清液pH，參照國標GB 5009.239—2016《食品安全國家標準食品酸度的測定》中的方法測定滴定酸度[8]。

1.3.4 菌株耐酸、耐膽鹽能力篩選

（1）耐酸性試驗

用1 mol/L的HCl溶液調節MRS液體培養基的pH值至2.0、3.0、4.0、5.0，以初始MRS液體培養基（pH 6.5）為對照，將產酸凝乳篩選出的菌株按2%（V/V）接種量接種于不同pH值梯度的培養基中，并以不接菌種的MRS培養基為空白對照，于37 ℃厭氧培養16 h，測各組菌液的OD600nm值，其生長率計算公式如下[9]：

式中：c為生長率，%；An為培養基pH為2.0、3.0、4.0、5.0時的OD600nm值；A1為pH初始培養基的OD600nm值；A0為空白對照培養基的OD600nm值。

（2）膽鹽耐受性實驗

將產酸凝乳篩選出的菌株按2%（V/V）接種量接種于膽鹽質量濃度分別為0.3 g/L、0.6 g/L、0.9 g/L、1.2 g/L的MRS液體培養基中，以不含膽鹽的初始MRS液體培養基為對照，并以不接菌種的MRS培養基為空白對照，37 ℃厭氧培養16 h，測各組菌液的OD600nm值，按上式計算其生長率。

1.3.5 菌種PCR擴增及序列鑒定

篩選菌種的PCR擴增參考文獻[10]。并將所得擴增產物送至北京睿博生物科技有限公司進行測序，測序結果經拼接后在美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源比對。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌計數及分離結果

通過計數結果顯示，奶嚼口（XS-Z）中乳酸菌活菌數為（12.60±0.78）lg（CFU/mL），下層凝乳（XS-E）中乳酸菌活菌數為（12.31±0.35）lg（CFU/mL）。霍瑞等[11]通過對錫林郭勒盟地區售賣的29份奶嚼克樣品進行乳酸菌計數表明，活菌數在4.90～7.30 lg（CFU/mL）之間。張哲等[12]對俄羅斯卡爾梅克地區酸奶油樣品中乳酸菌多樣性進行分析研究，結果顯示其活菌數平均值為（8.12±0.46）lg（CFU/mL）。而本實驗所采集的奶嚼口及下層凝乳中乳酸菌的活菌數均達到12.3 lg（CFU/mL）以上，遠大于發酵奶油樣品的平均水平，這可能是由于乳酸菌的活菌數量在很大程度上受到采樣地區、采樣季節以及自然發酵時間的影響。從樣品中共分離獲得200株乳酸菌。

2.2 菌株產酸、凝乳能力篩選結果

產酸能力是乳酸菌的重要特性，乳酸菌通過發酵鮮乳中的乳糖生成乳酸、乙酸、檸檬酸等有機酸，能夠降低胃腸道pH，抑制腸道病原菌，調節腸道菌群平衡[13-15]。因此產酸是評價乳酸菌活力和篩選優良菌株的重要指標。凝乳是酸奶等乳制品生產的關鍵環節，在生產凝乳制品的過程中，多靠控制凝乳過程及性質來達到控制產品質構與風味特征的目的[16-17]。本實驗參考食品國家安全標準發酵乳的理化指標及限量值設定篩選條件[18]：發酵8 h，酸度＞60°T，且凝乳效果較好的菌株為產酸凝乳優良的菌株。奶嚼口中菌株的產酸能力以及下層凝乳中產酸凝乳能力的篩選結果見圖1、圖2。

由圖1、圖2可知，酸度標記放大的散點即為滿足篩選條件的菌株，其最終篩選結果見表1。由表1可知，奶嚼口樣品中共篩選到12株具有較好產酸能力的菌株，其中菌株XS-Z-037、XS-Z-042、XS-Z-043、XS-Z-045、XS-Z-048 有少量乳清析出；下層凝乳樣品中共篩選到7株產酸凝乳效果較好的菌株，其中菌株XS-E-001、XS-E-033、XS-E-099、XS-E-100有少量乳清析出。由此可知，奶嚼口樣品中所分離的具有產酸凝乳能力的乳酸菌多于下層凝乳中所篩選的菌株。

圖1 奶嚼口中菌株的產酸能力篩選Fig.1 Screening of acid production ability of strains in milk chew

圖2 下層凝乳中菌株的產酸凝乳能力篩選Fig.2 Screening of acid production ability of strains in lower curd

表1 產酸凝乳菌株最終篩選結果Table 1 Final screening results of acid producing and curding strains

2.3 菌株耐酸性實驗結果

將產酸凝乳篩選所得的19株乳酸菌進行耐酸性實驗，結果見表2。由表2可知，當培養基pH值為5的條件下，奶嚼口樣品中的菌株的平均生長率為（42.25±7.66）%，其最大生長率為50.76%；下層凝乳樣品中的菌株平均生長率為（36.26±10.04）%，最大生長率為46.53%。所篩選的19株菌在pH值為2～4范圍的酸性條件下，其生長率均＜5%，對酸性條件的耐受性較差。胃是人體重要的消化器官，正常胃液pH值在1.5～4.5之間，其強酸環境是阻礙大多數微生物進入腸道的重要屏障[19-20]。當胃液pH值為2.0時，幾乎所有菌株都不能在其中繁殖生長，而當pH值為4.0時，不同屬種來源的乳酸菌會表現出不同程度的耐受性[21]。如乳桿菌生長的pH范圍為4.5～7.0，多數乳桿菌在pH值為4.0的條件下不能生長[22]。而本實驗所篩選的19株菌對酸性條件的耐受性均較差，這可能是與菌株本身屬種特性有關，還需進一步菌種鑒定驗證。

表2 不同pH條件下耐酸性菌株篩選結果Table 2 Screening results of acid-resistant strains under different pH conditions

2.4 菌株耐膽鹽實驗結果

模擬人體小腸內膽鹽的耐受性是篩選乳酸菌的基本標準之一，乳酸菌要想在腸道內定植發揮益生作用，必須能夠耐受一定濃度的膽鹽環境，而通常小腸內的膽鹽濃度大約在0.03%～0.30%[23-24]。本實驗將奶嚼口和下層凝乳樣品中篩選得到的19株菌分別進行膽鹽耐受性實驗，結果見表3。由表3可知，隨著膽鹽質量濃度的升高，各菌株的生長率隨之降低，其生長受到不同程度的抑制。奶嚼口樣品中所篩選的菌株XS-Z-029、XS-Z-035、XS-Z-090在0.3 g/L的膽鹽質量濃度下，其生長率分別為85.56%、87.56%、67.69%；其中菌株XS-Z-029、XS-Z-035在0.6 g/L的高膽鹽質量濃度下，其生長率可達60.12%和63.02%，均表現出良好的耐受性。而下層凝乳樣品篩選的菌株與奶嚼口相比對膽鹽的耐受性較差，只有在0.3 g/L的膽鹽質量濃度下有4株菌的生長率超過50%，分別為菌株XS-E-001（54.68%）、菌株XS-E-019（55.20%）、菌株XS-E-033（50.85%）、菌株XS-E-099（51.51%）。

表3 不同膽鹽濃度下耐膽鹽菌株篩選結果Table 3 Screening results of bile salt tolerant strains at different bile salt concentrations

2.5 菌種序列鑒定結果

將經產酸凝乳篩選得到的19株菌進行序列測序同源比對后，其結果見表4。由表4可知，奶嚼口樣品經產酸凝乳篩選得到的12個單菌株經測序后，11株為乳酸乳球菌（Lactobacillus lactis），1株為屎腸球菌（Enterococcu faecium），其同源相似性均達到97%以上。下層凝乳樣品經產酸凝乳篩選得到的7個單菌株測序后均為乳酸乳球菌（L.lactis），且其同源相似性均為100%。霍瑞[11]從錫林郭勒地區采集的奶嚼克樣品中分離鑒定出182株乳酸菌，分別隸屬于乳球菌屬（Lactococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、腸球菌屬（Enterococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）5個屬的14個種，其中乳酸乳球菌所占比重高達46.70%。旭日花[25]從內蒙古通遼牧區的酸奶、鮮奶和奶嚼口樣本中分離得到61株乳酸菌，多數歸屬于乳球菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬、明串珠菌屬和漫游球菌屬（Vagococcus）。本實驗篩選出的19株乳酸菌除菌株XS-Z-035為屎腸球菌（Enterococcu faecium），其余均為乳酸乳球菌（Lactobacillus lactis），這與上述研究報道所鑒定的菌種屬種相一致。通過對所篩選菌種的鑒定可知，奶嚼口和下層凝乳中乳酸菌種類之間并無明顯差別。

表4 篩選菌株分子生物學鑒定結果Table 4 Identification results of molecular biology of screened strains

3 結論

本實驗通過對奶嚼口和下層凝乳中乳酸菌種類和數量之間的比較分析可知，兩者之間所含乳酸菌活菌數相近，從奶嚼口和下層凝乳中篩選出的19株乳酸菌除1株為屎腸球菌，其余18株均為乳酸乳球菌，菌株屬種分類幾乎沒有區別。因此初步推斷奶嚼口和下層凝乳由于來源于同一鮮奶的發酵產物，其乳酸菌種類和數量之間并無明顯差別。所篩選的19株乳酸菌對酸性條件的耐受性均較差，奶嚼口樣品中篩選出的乳酸菌較下層凝乳對膽鹽的耐受性強，其中XS-Z-029和XS-Z-035 兩株乳酸菌表現出較好的膽鹽耐受性，具有潛在功能益生菌的開發的可能。