醬香型白酒第四、五輪次基酒中游離氨基酸分析

吳錢弟，周榆林，王久明，郭 鵬，王 鼎，羅愛民*

（1.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都 610065；2.四川宜府春酒廠有限責(zé)任公司，四川成都 611500）

醬香型白酒具有醬香突出、幽雅細(xì)膩、酒體醇厚、空杯留香持久的突出特點(diǎn)[1]，深受國人乃至世界人民的喜愛。醬香型白酒具有獨(dú)特的釀造工藝：高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒，生產(chǎn)周期長、貯存時間長，用曲量大，多輪次取酒[2-3]，賦予了其獨(dú)一無二的風(fēng)味。

醬香型白酒多輪次釀造過程中，加曲、堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵是醬香型白酒釀造獨(dú)特的關(guān)鍵工藝[4]。大曲為釀造過程帶來多種微生物和酶類，使其分解原料中的糖類和蛋白質(zhì)供微生物利用及生成風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)[5]。堆積發(fā)酵是窖池發(fā)酵的前提條件，屬于邊糖化邊發(fā)酵的過程，通過堆積發(fā)酵生成醬香或醬香前體物質(zhì)[6-7]。堆積發(fā)酵結(jié)束后，酒醅進(jìn)行窖池內(nèi)發(fā)酵，在微生物的作用下，繼續(xù)利用各類原料和前體物質(zhì)進(jìn)一步生成各類香氣成分[8-9]。

在微生物發(fā)酵生成風(fēng)味物質(zhì)的過程中，游離氨基酸作為微生物生長代謝賴以生存的氮源來源之一，在某種程度上決定了微生物的生長情況和代謝物的產(chǎn)生[10-11]。更重要的是，游離氨基酸作為多種香氣成分的前體物質(zhì)，在高溫堆積和高溫餾酒過程中可與碳水化合物發(fā)生美拉德反應(yīng)，是形成醬香風(fēng)味的重要原因[12-14]。另外，游離氨基酸還是酸、酯等香氣成分的重要前體物質(zhì)，不同的氨基酸能呈現(xiàn)甜、鮮、苦等味道，對白酒的風(fēng)味及口感形成起著重要作用[10，15]。國內(nèi)外學(xué)者對于蒸餾酒中的氨基酸已有較多研究[16-18]，AQUINO F W等[17]研究了巴西甘蔗酒、朗姆酒和威士忌中20種氨基酸發(fā)現(xiàn)脯氨酸含量最高，氨基酸與其風(fēng)味和質(zhì)量參數(shù)存在一定關(guān)系。張莊英等[18]對醬香型、濃香型、清香型、鳳香型、兼香型、豉香型和老白干香型的原酒和成品酒氨基酸種類和含量進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)原酒中醬香型和濃香型氨基酸種類最多，成品酒中醬香型白酒氨基酸種類最多。然而，游離氨基酸作為醬香型白酒中重要的香味組成和多種香氣成分的重要前體物質(zhì)，在釀酒過程中卻研究較少。在總共七個輪次的醬香型白酒生產(chǎn)中，第四、五輪次的基酒風(fēng)味最為突出，香氣成分更為豐富[19]，其中豐富的前體物質(zhì)游離氨基酸發(fā)揮著不可替代的作用。本研究通過全自動氨基酸分析儀對醬香白酒釀造中第四、五輪次加曲酒醅、入池酒醅和出池酒醅中游離氨基酸分析，旨在為研究基酒中的香氣成分提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)化合物（牛磺酸，磷-乙醇胺，天冬氨酸，蘇氨酸，絲氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，α-氨基肥酸，甘氨酸，丙氨酸，瓜氨酸，α-氨基正丁酸，纈氨酸，胱氨酸，胱硫醚，蛋氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，正亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，高胱氨酸，β-氨基異丁酸，γ-氨基正丁酸，組氨酸，1-甲基組氨酸，色氨酸，肌肽，鵝肌肽，羥基賴氨酸，鳥氨酸，賴氨酸，氯化銨，乙醇胺，精氨酸，羥基脯氨酸，脯氨酸）（均為色譜純）、鋰鹽體系（見表1）：德國曼默博爾公司；磺基水楊酸、茚三酮（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司。

表1 鋰鹽體系的配制Table 1 Preparation of lithium salt system

1.2 儀器與設(shè)備

A300全自動氨基酸分析儀：德國membraPure公司；5810R臺式冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；WT10002K電子天平：上海梅特勒-托利多有限公司；YM-1000CT超聲儀：上海豫明儀器有限公司；PHSJ-4F型pH計：上海儀電科學(xué)儀器。

1.3 試驗方法

1.3.1 醬香型白酒釀造及取樣方法

取樣方法：四川某醬香型白酒釀造車間，以某正常生產(chǎn)的窖池為取樣目標(biāo)，在釀造第四、五輪次的加曲酒醅，入池酒醅和出池酒醅中取樣。每次先在3個階段酒醅的上、中、下分別取30 g左右，然后將3份樣品混勻，待測。

1.3.2 制備樣品

稱取酒醅25 g，加入體積分?jǐn)?shù)57%vol乙醇50 mL，在25 ℃條件下超聲處理20 min（100 W，20 kHz），于8 000 r/min離心10 min。取上清液400μL于帶過濾膜的小離心管中，加入100 μL 10%磺基水楊酸，混合均勻，置冰箱中2～8 ℃冷藏靜置60 min，然后置離心機(jī)中以12 000 r/min離心15 min，取上層清液后再次以12 000 r/min離心5 min，上清液用樣品稀釋液按1∶10稀釋，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機(jī)分析。

1.3.3 分析條件

分析柱：鋰鹽分析色譜柱；泵1：A、B、C、D、E、F六個鋰鹽流動相（具體見表1），每個流動相的分配時間約為A 20 min，B 15 min，C 35 min，D 10 min，E 50 min，F(xiàn) 20 min，150 min程序，流速180 μL/min，0～12 MPa；泵2：茚三酮溶液流動相，流速180 μL/min，0～12 MPa；測量環(huán)境：溫度15～25 ℃，相對濕度40%～55%。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

每個試驗均處理3個重復(fù)，運(yùn)用AminoPeak2.44外標(biāo)法定量計算各氨基酸的含量，運(yùn)用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，SIMCA-P15.0對樣品和游離氨基酸進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品及樣品檢測譜圖

混合氨基酸及其相關(guān)化合物標(biāo)準(zhǔn)譜圖見圖1。由圖1可知，通道A（570 nm）共檢測到35種氨基酸和化合物，通道B（440 nm）檢測到羥基脯氨酸和脯氨酸兩種氨基酸。各種氨基酸的分離效果良好，運(yùn)用AminoPeak2.44處理譜圖，以峰面積定量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的校正因子和樣品稀釋因子計算樣品中氨基酸的含量。

第四輪次和第五輪次游離氨基酸檢測譜圖分別見圖2和圖3。由圖2可知，第四輪次的加曲酒醅（圖2A）、入池酒醅（圖2B）和出池酒醅（圖2C）檢測到的游離氨基酸譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜圖比較，分離效果良好，且在三個階段檢測到的氨基酸種類差別不大。由圖3可知，第五輪次的游離氨基酸譜圖分離效果良好，且加曲酒醅（圖3A）、入池酒醅（圖3B）和出池酒醅（圖3C）三個階段檢測到的氨基酸種類幾乎相同。

圖1 氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品色圖譜Fig.1 Chromatogram of mixed amino acids standards

圖2 第四輪基酒加曲（A）、入池（B）及出池（C）酒醅游離氨基酸色譜圖Fig.2 Chromatogram of free amino acids for fermented grains of adding Daqu (A),loading pits (B) and unpoading pits (C)in the fourth rounds base liquor

圖3 第五輪基酒加曲（A）、入池（B）及出池（C）酒醅游離氨基酸色譜圖Fig.3 Chromatogram of free amino acids for fermented grains of adding Daqu (A),loading pits (B) and unloading pits (C)in the fifth rounds base liquor

2.2 兩輪次總游離氨基酸比較分析

第四、五輪次酒醅在不同階段游離氨基酸總量見圖4。由圖4可知，加曲、入池和出池三個階段酒醅的總游離氨基酸含量呈增加趨勢，出池酒醅中的游離氨基酸總量最高，幾乎是加曲酒醅游離氨基酸總量的兩倍，說明醬香型白酒在堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵兩個階段產(chǎn)生大量的游離氨基酸，為高溫餾酒階段生成香氣成分保證了大量的物質(zhì)基礎(chǔ)。經(jīng)過上一輪次的高溫餾酒，大量的游離氨基酸已轉(zhuǎn)化為酒體中的香味物質(zhì)，因此加曲酒醅中游離氨基酸含量最低[20]。縱向來看，第五輪次的加曲酒醅和出池酒醅游離氨基酸均明顯高于第四輪次同階段的游離氨基酸總量，第四、五兩輪次的基酒風(fēng)味成分豐富[21]，因此在這兩個輪次中游離氨基酸總量是增加的，這或許有助于基酒風(fēng)味物質(zhì)的形成。

圖4 第四、五輪次基酒各階段酒醅總游離氨基酸含量Fig.4 Total contents of free amino acids at each stage of fermented grains in the fourth and fifth rounds base liquor

根據(jù)各酒醅游離氨基酸總量的差異，對兩個輪次各酒醅進(jìn)行差異性分析，結(jié)果見圖5。由圖5可知，兩個輪次各階段的酒醅差異均較大。第四輪次三個階段的酒醅彼此之間的差異較小。在第五輪次中，加曲酒醅和入池酒醅的差異較小，但是與出池酒醅的差異較大。值得注意的是，第四輪次的出池酒醅和第五輪次的加曲酒醅差異卻很小。因此，堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵過程產(chǎn)生更多的游離氨基酸，而大曲粉帶來的游離氨基酸更少。

圖5 第四、五輪次基酒醅游離氨基酸總量差異性分析Fig.5 Difference analysis of total free amino acids of fermented grains in the fourth and fifth rounds base liquor

2.3 不同階段各游離氨基酸含量分析

第四、五輪次酒醅中各游離氨基酸含量分別見表2和表3。由表2和表3可知，在兩個輪次中，各酒醅中檢測到的氨基酸類別幾乎相同，第四輪次酒醅和第五輪次酒醅分別檢測到23種和21種氨基酸或化合物，其中天冬酰胺（Asn）和瓜氨酸（Cit）只在第四輪次的加曲酒醅中檢測到。在所有被檢測到的游離氨基酸中，中性氨基酸（蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro））的種類最多，酸性氨基酸（天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu））和堿性氨基酸（組氨酸（His）、賴氨酸（Lys）、精氨酸（Arg））種類較少。大多數(shù)游離氨基酸在加曲酒醅中的含量最低，從加曲酒醅到出池酒醅的發(fā)酵過程中，其含量逐漸增加，出池酒醅中的氨基酸含量最高，因此堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵產(chǎn)生了大部分的游離氨基酸，為醬香型白酒在高溫餾酒過程的風(fēng)味物質(zhì)形成提供了醬香或醬香物質(zhì)前體[22]。其中，丙氨酸（0.424 mg/g和0.86 mg/g），亮氨酸（0.408 mg/g和0.872 mg/g），谷氨酸（0.392 mg/g和0.716 mg/g）和組氨酸（0.372 mg/g和0.896 mg/g），在釀造的第四、五輪次中均有較高的含量，可能與某些風(fēng)味物質(zhì)的形成密切相關(guān)，如谷氨酸可在谷氨酸脫氫酶的作用下生成氨，與2,3-丁二醇生成香味物質(zhì)四甲基吡嗪[23]。

表2 第四輪次基酒各階段酒醅游離氨基酸含量Table 2 Contents of free amino acids in fermented grains at each stage of the fourth rounds base liquor

表3 第五輪次基酒各階段酒醅游離氨基酸含量Table 3 Contents of free amino acids in fermented grains at each stage of the fifth rounds base liquor

續(xù)表

2.4 不同階段各游離氨基酸差異性分析

運(yùn)用SIMCA-P 15.0分別對第四、五輪次酒醅所有游離氨基酸進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），結(jié)果見圖6和圖7。

圖6 第四輪次基酒游離氨基酸主成分分析Fig.6 Principal component analysis of free amino acids in the fourth rounds base liquor

由圖6可知，主成分PC1和PC2分別解釋了85.5%和14.5%的差異。大多數(shù)氨基酸聚集在一起，可歸為一類，說明各氨基酸之間存在一定的相關(guān)性，彼此間聯(lián)系緊密。但是，銨離子（NH4+）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、纈氨酸（Val）、磷-乙醇胺（phosphoethanolamine，PEA）和丙氨酸（Ala）六種氨基酸或化合物與其他氨基酸距離較遠(yuǎn)，因此與其他氨基酸之間的差異較大，同時他們彼此之間也存在一定的差異性。

圖7 第五輪次基酒游離氨基酸主成分分析Fig.7 Principal component analysis of free amino acids in the fifth rounds base liquor

由圖7可知，主成分PC1和PC2分別占96.3%和3.7%。第五輪次三個階段酒醅中各氨基酸間的差異與第四輪次相比較小，各氨基酸之間聯(lián)系更加緊密，彼此之間具有強(qiáng)相關(guān)性。另外，與其他氨基酸差異性較大的是銨離子（NH4+）、鳥氨酸（Orn）、牛磺酸（Tau）和磷-乙醇胺（PEA）四種化合物。值得注意的是，銨離子（NH4+）和磷-乙醇胺（PEA）兩種化合物在第四輪次中與其他氨基酸差異也較大，這可能與第四、五輪次基酒中風(fēng)味物質(zhì)的形成有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究通過茚三酮衍生法對醬香型白酒釀造過程第四、五輪次的加曲酒醅、入池酒醅和出池酒醅的游離氨基酸組成分析，在第四、五輪次分別檢測到23種和21種游離氨基酸或化合物，分別是蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、組氨酸（His）、賴氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、牛磺酸（Tau）、磷-乙醇胺（PEA）、天冬酰胺（Asn）、瓜氨酸（Cit）、1-甲基組氨酸（1Mehis）、鳥氨酸（Orn）和銨離子（NH4+），其中天冬酰胺（Asn）和瓜氨酸（Cit）僅在第四輪次的加曲酒醅中檢測到。

大多數(shù)游離氨基酸的含量從加曲到入池發(fā)酵過程中是逐步增加的，游離氨基酸主要在堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵過程產(chǎn)生。大多數(shù)氨基酸間均存在較強(qiáng)的相關(guān)性，只有銨離子（NH4+）和磷-乙醇胺（PEA）兩種化合物在兩個輪次中均與其他氨基酸表現(xiàn)出較差的相關(guān)性。第五輪次各階段酒醅中游離氨基酸含量高于第四輪次同階段酒醅的游離氨基酸含量，且第五輪次與第四輪次相比，各游離氨基酸彼此間的相關(guān)性更強(qiáng)。游離氨基酸在醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的生成中發(fā)揮著不可替代的作用，通過研究基酒香氣成分豐富的兩個輪次在釀造過程游離氨基酸的產(chǎn)生情況，為研究醬香型白酒中風(fēng)味物質(zhì)的生成提供了理論基礎(chǔ)。