白酒大曲真菌群落結構多樣性研究技術與進展

文 章，程 鵬，陳 才，劉緒興，馮 潛，楊生智，陳 杰*

（1.宜賓六尺巷酒業有限公司，四川宜賓 644000；2.勁牌有限公司，湖北黃石 435000）

中國白酒是世界六大蒸餾酒之一，是我國特有的一種經固態發酵而得的蒸餾酒，其獨特的生產工藝造就了別具一格的產品風格[1]。大曲作為白酒固態釀造的糖化劑、發酵劑以及生香劑，是白酒固態釀造的物質基礎。大曲按照其生產產品的特點，分為濃香大曲、清香大曲、醬香大曲、兼香大曲等。傳統白酒大曲中主要有三系（物系、菌系和酶系），其中菌系主要由細菌、霉菌、酵母以及放線菌等微生物組成。大曲中微生物主要來源于生產環境，包括空氣、制曲用水、原料、器具以及曲房環境等。傳統制曲的實質是與釀酒相關微生物的擴大培養過程，即將來源于環境中的野生菌種進行自然培養，并通過翻曲和通風排潮等人為干預的方式，淘汰雜菌選育出有益菌種的過程。由于試驗方法和條件的落后及局限，初期對大曲中各種微生物的功能及群落結構多樣性研究時主要采用傳統可培養技術。近年來，隨著具有高可信度、高分辨力及快速靈敏等優點的現代分子生物學方法在研究微生物群落結構上的快速發展[2]，給傳統的微生物可培養技術及微生物分類鑒定等方面帶來了巨大的革新，對傳統可培養方法的缺陷起到了一定的彌補作用[3]，因此現代分子生物學方法逐漸被引入到大曲微生物的研究當中。

雖然真菌在大曲發酵體系中具有極其重要的作用，但是相對于細菌的研究，對于真菌的研究就相對較少?；诖?，該文主要闡述大曲中真菌群落結構多樣性的研究技術以及研究進展，以期為研究大曲發酵過程中真菌多樣性構成及變化規律，解析各種真菌的功能及相互作用，提高大曲質量以及形成對傳統大曲固態發酵機理的最新認識奠定理論基礎。

1 微生物群落多樣性研究技術

21世紀以來，微生物群落結構及多樣性研究已經成為微生物生態學以及環境科學的研究重點和熱點[4]，全面剖析目標樣品中微生物群落結構及多樣性，為揭示微生物具體代謝功能、控制和優化群落結構、強化目標微生物的代謝功能等提供理論依據[5-6]。微生物群落結構及多樣性解析技術的發展主要經歷了傳統可培養技術、生理學指紋法及生物標記物方法、結合聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術的傳統分子生態學技術、高通量測序技術等四個階段。隨著微生物生態學的發展及研究技術的不斷升級，中國白酒釀造微生物的群落多樣性的研究手段也由傳統可培養技術逐漸升級為下一代測序技術。

1.1 傳統可培養技術

可培養分離技術是最早應用于研究微生物群落結構及多樣性的重要手段[4]。該技術是將樣品或樣品稀釋液接種于固體培養基中，在一定條件下培養后對培養基上生長的菌落進行統計，并通過其菌落形態、微觀結構以及生理生化等特性進行微生物種屬鑒定。由于該方法忽略了來源環境或發酵體系中的養分與人工培養基的差異以及不同微生物之間的相互作用，這就直接導致樣品中許多可培養微生物的種類和數量大大減少。AMANN R I等[7]研究指出，自然環境中的微生物僅10%能夠被人工培養分離，同時傳統可培養技術操作繁瑣、準確性較差，不能滿足監測群落結構動態變化的需求。因此，傳統可培養技術在微生物群落結構及多樣性研究中使用得越來越少[8]。

盡管傳統可培養技術具有上述不可避免的局限性，但是該技術到現在仍在被廣泛使用，原因之一便是能夠得到從樣品中得到活菌，便于后續研究。研究人員通過可培養方法逐步揭示了大曲中微生物優勢菌群的種屬分布，在一定程度上促進了制曲技術的快速發展[9]。傳統微生物分類鑒定方法（可培養技術）應用于研究大曲（清香型、濃香型和醬香型）中真菌群落結構多樣性的情況見表1。

表1 可培養技術在大曲真菌研究中的應用情況Table 1 Application of culture-dependent technology in fungi study of Daqu

1.2 現代分子生物學技術

1.2.1 磷脂脂肪酸技術

磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）指紋圖譜技術已經廣泛應用于研究復雜體系的微生物群落及動態變化規律[2]。PLFA是除古生菌以外其他所有微生物活細胞細胞膜的主要成分，并且環境中PLFA含量與目標環境中活性微生物生物量具有很好的相關性[18]。由于不同微生物種屬的PFLA結構及種類存在一定差異，因此可以作為微生物標記物，用于研究微生物的群落結構，同時該技術也用于微生物菌株的輔助鑒定[19]。

PLFA指紋圖譜技術應用于研究大曲（清香型、濃香型和醬香型）中真菌群落和多樣性的具體情況見表2。

表2 磷脂脂肪酸技術在大曲真菌研究中的應用情況Table 2 Application of phospholipid fatty acid technology in fungi study of Daqu

1.2.2 聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳

表3 PCR-變性梯度凝膠電泳技術在大曲真菌研究中應用情況Table 3 Application of PCR-denaturing gradient gel electrophoresis technology in fungi study of Daqu

聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術是一種經典的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）指紋圖譜技術，是用于研究環境微生物群落結構的重要手段[19]。通過比較DNA指紋圖譜中的條帶（數目及亮度）能夠剖析樣品中微生物的群落組成以及多樣性，若對圖譜中的條帶進行測序分析就能進一步獲得樣品中微生物的系統發育地位[27]。PCR-DGGE技術已經廣泛用于環境及發酵體系中微生物群落組成、多樣性及動態變化的研究。與其他方法相比，PCR-DGGE是目前國內用于白酒釀造環境中微生物群落組成及多樣性研究的最常用手段。PCR-DGGE技術應用于大曲真菌群落和多樣性研究情況見表3。

1.2.3 聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態性技術

聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態性技術（polymerase chain reaction-single chain conformation polymorphism technique，PCR-SSCP）技術與PCR-DGGE技術相似，但是原理有明顯的差異。SSCP技術是根據各類堿基組成的單鏈DNA形成的不同三維構象進行區分，當不同三維構象的單鏈DNA分子在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）中因遷移率不同而形成將DNA條帶進行分離，從而將長度相同但DNA序列不同的片段分離開來[2]。由于樣品中不同微生物種屬的rDNA基因序列堿基組成存在差異，通過對PAGE上各DNA條帶測序后進行分析，就能進行樣品中微生物系統發育的研究[19]。因此，該方法也常用于大曲樣品中微生物群落多樣性的剖析。PCR-SSCP技術應用于大曲真菌群落和多樣性研究情況見表4。

表4 PCR-單鏈構象多態性技術在大曲真菌研究中應用情況Table 4 Application of PCR-single-strand conformation polymorphism technology in fungi study of Daqu

1.2.4 基因文庫

基因克隆文庫技術可剖析目標樣品中各類微生物的種類及對應比例，通過該技術能夠檢測出不能人工分離培養的微生物。通過建立目標樣品中微生物的基因文庫，再測定文庫中的基因序列，從而可以得到樣品中所含微生物基因的種類和相對數量[2]。目前基因克隆文庫技術已經廣泛應用于環境微生物學及生態學的相關研究，其中最為常用的是核糖體RNA基因克隆文庫的構建，包括細菌16SrDNA基因克隆文庫、真菌18S rDNA基因克隆文庫以及真菌ITS基因克隆文庫[2]?；蚩寺∥膸旒夹g能準確獲得目標樣品中微生物的基因序列信息，從而可以檢測出樣品中微生物群落中的優勢菌群。該技術已廣泛應用多種環境及發酵體系中微生物群落組成、多樣性和動態變化規律及平行樣品間微生物群落差異性比價研究?；蚩寺∥膸旒夹g應用于大曲真菌群落和多樣性研究情況見表5。

表5 基因克隆文庫技術在大曲真菌研究中應用情況Table 5 Application of gene clone library technology in fungi study of Daqu

1.2.5 高通量測序技術

高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）技術，又稱為“下一代”測序（next-generation sequencing technology，NGS）技術，是新一代的基因測序技術。該技術一次最多能并行測定幾百萬條DNA分子序列，并且讀長較短，能夠深入、細致、全貌的分析一個物種的轉錄組和基因組。目前常用的二代測序平臺主要有Solexa、SOLiD和454等3種平臺。由于高通量測序的各種優點，其越來越多的被用于研究大曲、窖泥中微生物群落結構多樣性。高通量測序技術應用于大曲真菌群落和多樣性研究情況見表6。

表6 高通量測序技術技術在大曲真菌研究中應用情況Table 6 Application of high-throughput sequencing technology in fungi study of Daqu

續表

1.2.6 組學技術

組學（Omics）是一項具有廣闊應用前景的新興技術，按照分析目標不同分為基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學等[54]。目前應用于復雜環境中微生物多樣性研究較多且較為成熟的技術是宏基因組學技術。它是HANDELSMAN J等[55]于1998年首次提出，將宏基因組定義為環境中全部微小生物遺傳物質的總和[56]。隨著高通量測序技術的不斷發展，宏基因組學被廣泛應用于自然環境中微生物群落結構（如水、空氣、土壤、海洋等）、發酵食品微生物群落結構（奶酪、漿水菜、普洱茶、泡菜等）以及腸道微生物群落結構（人體及其他動物）的研究。宏基因組學技術應用于食品微生物群落和多樣性研究情況見表7。

表7 宏基因組學技術在發酵食品微生物多樣性研究中的應用Table 7 Application of metagenomic technology in microbial diversity study of fermented food

目前，宏基因組學在大曲微生物的研究中應用較少，在此簡要介紹了近年來宏基因組學技術在一些發酵食品中的應用情況，以期為利用宏基因組學分析大曲微生物群落結構多樣性以及發現性新的功能基因提供一定的參考依據。

1.2.7 微生物群落多樣性的研究手段優缺點比較

隨著各種微生物分離技術的不斷發展和進步，能被分離出來的微生物越來越多，但在實驗室條件下分離出來的微生物種類仍不足環境微生物的10%[7]。同時，雖然各種微生物群落和多樣性的研究方法也在不斷發展，但是每種方法都有其優缺點，因此對微生物群落和多樣性的研究不能局限某一研究方法上，必須結合現代分子生物學的各種方法，包括傳統可培養分離技術，這樣才能對可培養微生物和非可培養微生物有一個系統的認識。各種微生物群落和多樣性研究方法的優缺點比較見表8。

表8 微生物群落結構多樣性研究方法的比較Table 8 Comparison of research technology on microbial community structure diversity

2 大曲中真菌多樣性

大曲中的主要微生物種類是霉菌、酵母菌、細菌和放線菌四大類。大曲發酵體系中的微生物菌系不斷發生著復雜的動態變化，其中霉菌是豐度最高的微生物類群，其次是酵母和細菌[17]。大曲中霉菌的特殊作用（如為釀造提供糖化力、液化力、蛋白質分解能力以及多種有機酸等物質）決定著大曲各方面的質量特性，霉菌菌群的功能分化，對大曲的質量起著關鍵的作用[69]。酵母菌為大曲提供發酵力，作為大曲微生物區系中最重要的類群之一，不僅主導了酒精的產生，而且大量產生酯類、醇類、酮類、烯類、酚類等揮發性化合物，對大曲和大曲酒的品質有著決定性的影響[70]。

不同類型大曲中分離出的霉菌和酵母菌種類見表9。從表9中可知，各類大曲中霉菌和酵母菌多樣性差異較大，且濃香型大曲＞清香大曲＞醬香大曲，同時大曲中霉菌多樣性少于酵母菌[58]。各類大曲中均有的真菌主要有根霉屬、曲霉屬、毛霉屬、橫梗霉屬、嗜熱真菌屬以及對大曲及大曲酒釀造有害的青霉屬等；三類大曲中共同的酵母菌主要有酵母屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、復膜孢酵母屬、伊薩酵母屬等。

表9 不同類型大曲中霉菌和酵母菌對比Table 9 Comparison of mold and yeast in different types of Daqu

3 展望

近年來，隨著各種現代分子生物學新技術的不斷完善與發展，對大曲中真菌群落結構的研究不再受傳統微生物純培養技術的限制，同時使用這些新興的高新技術可以從不同的維度來研究大曲中真菌群落結構的多樣性，為大曲中真菌群落結構及多樣性解析奠定了堅實的基礎。需要特別指出的是，由于各種方法均具有一定的局限性，因此為了獲得更為全面地解析大曲中真菌群落結構多樣性的信息，在研究過程中應當根據研究目的，選擇合適的一種或多種方法結合起來使用，形成優勢互補，才能更有效地挖掘和利用大曲中真菌多樣性信息。目前對于大曲中真菌群落結構多樣性的研究是多方面的，通過對其多樣性的研究必能為大曲質量以及曲酒質量的提升提供理論基礎。