UPLC同時測定清熱止咳顆粒中7種黃酮類成分含量

李鷙，余淑美，余代鑫，于娟，袁慧君，林少華，徐偉*

(1.福建中醫藥大學藥學院，福建福州350122；2.漳州片仔癀藥業股份有限公司，福建漳州363000)

清熱止咳顆粒由黃芩、陳皮、枳殼、知母、浙貝母、重樓、桔梗等14味中藥組成，具有清熱化痰、宣肺止咳的功效，用于痰熱阻肺所致的咳嗽，痰黏稠或黃，發熱，急性支氣管炎、慢性支氣管炎(單純型)急性發作的證候[1]。處方黃芩中的黃芩苷具有抗炎[2]、抗流感病毒[3]等作用，陳皮中的指標性成分橙皮苷有抗病毒[4]的作用，枳殼中的活性成分柚皮苷和新橙皮苷具有抗炎、抗氧化[5-6]等藥效，黃酮類成分被認為是清熱止咳顆粒主要藥效成分之一。但目前清熱止咳顆粒的質量控制僅以薄層鑒別和黃芩苷單一成分的含量測定為主[7]，檢測指標單一，對于14味藥的大復方質量控制不夠全面。因此建立能同時測定其中多種指標成分的方法，對于其質量控制和確保療效具有重要的意義。

近年來，超高效液相色譜(UPLC)法廣泛運用于中藥及其復方分析研究中[8-10]，具有高分析效率、高靈敏度的優點，可顯著減少分析時間，同時會減少色譜溶劑的消耗。經查閱國內外文獻，鮮有見UPLC法定量評價清熱止咳顆粒的報道，故本試驗建立UPLC法同時測定清熱止咳顆粒中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷7個指標性成分的含量，為復方清熱止咳顆粒的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1290型超高效液相色譜儀(美國 Agilent公司)；CPA225D型十萬分之一分析天平(德國Sartorius公司)；KQ-500E臺式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

對照品柚皮苷(批號：110722-201714)、橙皮苷(批號：110721-201617)、新橙皮苷(批號：111857-201703)、黃芩苷(批號：110715-201720)、漢黃芩苷(批號：112002-201702)，均購自中國食品藥品檢定研究院；蕓香柚皮苷(批號：MUST-18030408，成都曼思特生物科技有限公司)；木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷(批號：14080123，上海同田生物技術股份有限公司)。清熱止咳顆粒(福建漳州片仔癀藥業股份有限公司，批號為 1804001、1804002、1804003、1804004、1804005、1804006、1709024)。 甲醇、乙腈、水均為色譜純(上海安譜實驗科技股份有限公司)，甲酸為色譜純(上海阿拉丁試劑有限公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7μm)，流動相乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～2 min，15%～20%A；2～5 min，20%～21%A；5～8 min，21%～25%A；8～12 min，25%～30%A；12～15 min，30%～70%A；15～15.1 min，70%～15%A；15.1～18 min，15%～15%A)，柱溫30℃，流速0.3 mL·min-1，進樣量5 μL，檢測波長280 nm。在此色譜條件下7個對照品與其他色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數均大于5 000，色譜峰對稱性良好。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密取蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和漢黃芩苷對照品適量，精密稱定，加入甲醇超聲溶解，制成質量濃度分別為0.648、1.070、0.552、1.078、1.108、0.660 和 0.484 mg·mL-1的單一對照品儲備液，備用。分別精密量取上述對照品溶液適量，置同一容量瓶中，加入50%甲醇至刻度，即得蕓香柚皮苷 6.480μg·mL-1、柚皮苷26.75 μg·mL-1、橙皮苷 13.80 μg·mL-1、新橙皮苷26.95 μg·mL-1、黃芩苷 55.40 μg·mL-1、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷6.600μg·mL-1和漢黃芩苷4.840μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取清熱止咳顆粒，研細，精密稱取0.1 g，置具塞三角瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min(功率250 W，頻率50 kHz)，放冷，再次稱重，70%甲醇補足減失重，搖勻，0.22μm濾膜濾過，取續濾液，得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按照清熱止咳顆粒處方工藝分別制備缺陳皮、缺枳殼、缺黃芩和同時缺陳皮和枳殼的陰性樣品，按供試品溶液制備方法，同法制備相應的陰性樣品溶液。

2.2.4 專屬性考察 分別取供試品溶液、對照品溶液及4種陰性樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行色譜分析，結果供試品溶液色譜中，與對照品相同保留時間處陰性樣品溶液無干擾，其中蕓香柚皮苷、橙皮苷來源于陳皮和枳殼，柚皮苷、新橙皮苷來源于枳殼，黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和漢黃芩苷來源于黃芩，UPLC色譜圖見圖1。

2.3 線性范圍考察 取蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和漢黃芩苷的混合對照品溶液，用50%甲醇稀釋配制為不同梯度濃度的混合對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進行測定。以蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和漢黃芩苷質量濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，分別繪制標準曲線，得回歸方程和線性相關系數r，結果見表1。

表1 清熱止咳顆粒中7個分析物的線性范圍考察

2.4 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液5μL，1 d內連續進樣6次，計算蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和漢黃芩苷峰面積的RSD分別為0.34%、0.19%、0.27%、0.25%、0.18%、0.29%、0.47%，結果表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗 取批號為1804005的清熱止咳顆粒，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 和 24 h 按“2.1”項下測定蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和漢黃芩苷的峰面積，結果RSD分別為0.22%、0.08%、0.18%、0.19%、0.22%、0.27%、0.33%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.6 重復性試驗 精密稱取同一批清熱止咳顆粒(批號：1804005)6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下測定各成分的峰面積，帶入標準曲線計算蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和漢黃芩苷峰的平均質量分數分別為0.05%、0.18%、0.12%、0.17%、0.67%、0.06%、0.06%，RSD 分別為 1.45%、1.84%、1.77%、1.16%、1.68%、1.24%、1.55%，結果表明方法重復性良好。

2.7 回收率試驗 取重復性試驗同批次清熱止咳顆粒約0.05 g，精密稱定，平行6份，每份分別精密加入近似等量的7種對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下測定各成分的峰面積，計算各個化合物的回收率和回收率的RSD結果見表2，結果表明該方法回收率良好。

2.8 樣品含量測定 取批號為1804001、1804002、1804003、1804004、1804005、1804006、1709024 的清熱止咳顆粒，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，依法測定各批次樣品，計算清熱止咳顆粒中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和漢黃芩苷的含量，結果見表3。

3 討論

清熱止咳顆粒由14味中藥組成，前期經過液相色譜-質譜(LC-MS)分析，按照成分類別主要為黃酮類、皂苷類、生物堿類和其他類。首先，皂苷類成分主要來源于方中的知母、桔梗、重樓和甘草，按照分析方法多需要ELSD來進行檢測，用目前的UPLC-DAD系統不適合；其次，生物堿類成分主要來自方中的貝母，如貝母素甲和貝母素乙等屬于生物堿類，因紫外末端吸收，《中國藥典》2015年版采用ELSD檢測器；第三，其他類成分，蒼耳子主要成分為有機酸綠原酸和蒼術苷，綠原酸出峰時間過快且含量較低，無法準確定量，而蒼術苷需要ELSD檢測；方中苦杏仁主要成分苦杏仁苷屬于末端吸收的氰苷類成分，在207 nm下檢測基線漂移較大；另外石膏主要成分為硫酸鈣，紫蘇葉主要成分為揮發油；第四，黃酮類成分，是最主要的一類成分，其中方中鴨跖草含有異葒草素、甘草含有甘草苷，但是兩者含量較低，出峰響應不好，而方中的黃芩、陳皮和枳殼，其含有的蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷7個成分含量較高，色譜峰典型，同時黃芩中的黃芩苷具有抗炎、抗流感病毒等作用，陳皮中的指標性成分橙皮苷有抗病毒的作用，枳殼中的活性成分柚皮苷和新橙皮苷具有抗炎、抗氧化等藥效，這些成分與清熱止咳顆粒主要藥效一致，因此選擇了黃芩苷等7種成分進行同時測定。

表2 清熱止咳顆粒7個分析物的回收率試驗結果(n＝6)

表3 清熱止咳顆粒中7個分析物的含量(mg·g-1)

檢測波長的選擇：通過對7個分析物進行DAD全波長掃描，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的最大吸收波長為283 nm，黃芩苷的最大吸收波長為277 nm，木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷的最大吸收波長為273 nm，綜合7種黃酮類成分在280 nm處均有良好的紫外吸收。因此，選擇280 nm作為檢測波長。

流動相選擇：分別比較了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水溶液系統及其不同比例梯度洗脫效果，結果發現用甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫時，7個黃酮類成分不能基線分離，柚皮苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等成分互相干擾，而改用乙腈-水梯度洗脫時，7種成分分離良好，但是黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和漢黃芩苷的峰形不佳，進一步改用乙腈-0.1%甲酸水溶液洗脫時，7個成分的分離效果明顯改善，且峰形較好，基線穩定。故最后采用乙腈-0.1%甲酸水溶液做為色譜流動相。

色譜柱的選擇：分別考察了ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、Thermo syncronis aQ 色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7μm)、CORTECSUPLC C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)、Ultimate UHPLC XB-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱，結果表發現Acquity UPLC HSS T3 C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8μm)在7個待測物的色譜峰峰形、分離度及保留時間上均優于其他3根色譜柱。

經過超高效液相色譜條件的優化，將同時測定的7種成分的分析時間壓縮到15 min，單針的溶劑消耗少于6 mL，與同類的復方分析[11-13]相比，具有明顯縮短分析時間和溶劑消耗。

通過分析方法學的驗證，本試驗驗證了該方法的精密度、穩定性、重復性、線性范圍和加樣回收率等均符合分析要求。最后通過對7批次的清熱止咳顆粒的含量測定，結果表明，黃芩苷的含量在6.590～6.977 mg·g-1，其含量是顆粒中最高的成分，來源于復方的黃芩藥材；其次，柚皮苷的含量在1.719～1.772 mg·g-1，新橙皮苷的含量在 1.638～1.689 mg·g-1，含量較高的成分，這兩種成分在枳殼和陳皮中均有分布，但是在陳皮中含量顯著低于枳殼[14-15]，因此本次枳殼陰性樣品中并未檢測出此成分，提示復方中的柚皮苷和新橙皮苷主要來源于枳殼藥材；第三，橙皮苷的含量在1.138～1.190 mg·g-1，蕓香柚皮苷的含量在0.431 3～0.452 0 mg·g-1之間，從陰性樣品分析來看，兩種成分在復方中的枳殼和陳皮藥材里均有分布，根據文獻報道橙皮苷在陳皮中的含量顯著高于枳殼[16-17]，但橙皮苷作為陳皮在《中國藥典》2015年版中規定含量測定的指標性成分[18]，提示復方中的橙皮苷主要來自于的陳皮藥材；第四，木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷含量在0.519 0～0.543 3 mg·g-1，漢黃芩苷的含量在0.539 8～0.580 5 mg·g-1，兩者含量相當，來源于復方的黃芩藥材。

根據中藥質量標志物Q-marker理論[19]，現代藥理研究表明黃芩苷能通過激活TLR7/MYD88信號通路，抑制 A型流感病毒感染小鼠肺炎癥反應[20]；漢黃芩苷等黃芩的黃酮類成分也具有顯著的抗炎活性[21]，枳殼中的柚皮苷類黃酮具有抗氧化應激的作用[22-23]，而陳皮中橙皮苷等黃酮可以通過AMPK信號通路調控細胞自主免疫，雙向影響甲型流感病毒復制和傳播[24]，提示清熱止咳顆粒中7種黃酮類成分可能可以通過抗病毒、抗炎或者抗氧化應激發揮止咳、抗流感的作用，所測定的7個黃酮類成分的藥理作用與清熱止咳顆粒的臨床功效相一致，因此黃芩苷等7個黃酮類成分是清熱止咳顆粒重要的Q-marker成分。

綜上所述，本試驗所建立的UPLC同時測定清熱止咳顆粒中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和漢黃芩苷含量的方法操作簡便、穩定、準確且可行，可以為清熱止咳顆粒質控的提升提供參考。