雷公藤紅素對人肺癌A549細胞增殖活性及能量代謝的影響

王淑靜，訾慶雪，付玉，劉琳，張文君，張家寧

(哈爾濱商業(yè)大學藥學院，黑龍江哈爾濱150076)

肺癌是一種臨床上常見的呼吸系統(tǒng)的惡性疾病，在我國腫瘤的發(fā)病率和死亡率中均居前列，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，對患者的生命安全造成了嚴重威脅[1-2]。目前，肺癌的化療主要采用鉑類藥物，如順鉑或卡鉑，但多次使用后會出現(xiàn)耐藥性，并且患者化療后生活質量較差[2]。因此，尋找行之有效的藥物及治療途徑對肺癌治療至關重要。

雷公藤紅素(celastrol)是衛(wèi)矛科植物雷公藤的主要活性成分之一，為醌甲基型五環(huán)三萜類化合物，分子式為C29H38O[3-4]，雷公藤紅素具有抗腫瘤、抗炎與抑制免疫、抑制血管生成、抗神經(jīng)退行性疾病、抗病毒、抗動脈粥樣硬化等藥理活性[5-7]。研究表明，雷公藤紅素具有良好的抗腫瘤活性，本文選取人肺癌細胞A549，從能量代謝的角度研究雷公藤紅素對腫瘤細胞的增殖抑制和促凋亡的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

1.1.1 主要材料 人肺癌細胞株(A549)，哈爾濱商業(yè)大學藥學院保存；雷公藤紅素(純度≥99.5%)，購于中國科學院成都研究所；RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶，購于Invitrogen公司；己糖激酶試劑盒、丙酮酸激酶試劑盒、乳酸脫氫酶試劑盒、琥珀酸脫氫酶試劑盒及ATP含量測定試劑盒，購于南京建成生物工程研究所。

1.1.2 主要儀器 MR-96A酶標儀酶標儀購自深圳邁瑞生物醫(yī)療股份有限公司；Mco-15AC CO2培養(yǎng)箱購自日本Sanyo El公司；3K30低溫離心機購自美國Sigma公司；CKX 41SF倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 人肺癌細胞株(A549)在含有10%胎牛血清及1%青鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。待細胞穩(wěn)定生長后，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 MTT法 取對數(shù)生長期的A549細胞，PBS漂洗，胰酶消化，調整細胞濃度為5×104個/mL。取96孔板，四周鋪100μL PBS，其余孔加細胞懸液100 μL，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，棄原培養(yǎng)液，各孔加由無血清的1640培養(yǎng)液配置雷公藤紅素，濃度梯度為 1.5、2、2.5、3、3.5、4 μg·mL-1，陽性對照組加5-FU(10μg·mL-1)，空白對照組加等體積無血清培養(yǎng)基，每組設置3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。 每孔加10μL MTT(5 μg·mL-1)培養(yǎng) 4 h，棄原液，每孔加150μL DMSO。490 nm酶標儀測吸光度值。計算細胞抑制率及IC50。

1.4 生長曲線 取對數(shù)生長期的A549細胞，PBS漂洗，胰酶消化，調整細胞濃度為5×104個/mL，取24孔板每孔加400μL細胞懸液，37℃培養(yǎng)24 h。棄原培養(yǎng)液，雷公藤紅素組、空白對照組分別加入400μL雷公藤紅素(終濃度為3μg·mL-1)和無血清培養(yǎng)基，每組設置3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。臺盼藍(0.04%)溶液染色，光鏡下細胞計數(shù)。每天取3個孔，每孔計數(shù)3次，求平均值，以活細胞數(shù)為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標繪制生長曲線圖。

1.5 HE染色 取對數(shù)生長期的A549細胞，胰酶消化制成細胞懸液，調整細胞濃度為5×104個/mL，接種于帶有蓋玻片的6孔板中，每孔1 mL，培養(yǎng)24 h，吸棄原培養(yǎng)液，每孔加入400μL雷公藤紅素(終濃度為3μg·mL-1)，空白組加入400μL無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。棄原液，取出蓋玻片，依次使用蘇木精染液和伊紅染液染色，37℃培養(yǎng)箱中干燥24 h后顯微鏡下觀察，具體方法參照文獻[8]。

1.6 能量代謝相關酶活力及代謝產(chǎn)物含量測定取對數(shù)生長期的A549細胞，PBS漂洗，胰酶消化，調整細胞濃度為2×105個/mL，取 接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h。實驗分組及給藥濃度同“1.5”項下，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。經(jīng)胰酶消化后吹打成細胞懸液，2 000 rpm離心5 min，棄上清。加0.9%生理鹽水重懸、離心，重復操作兩次。一般樣品處理將細胞懸液加入石英細胞勻漿器中，0℃手動勻漿6～8次，每次勻漿1 min，間隔30 s。ATP樣品處理將細胞懸液(不少于106個)加入300μL熱雙蒸水中，沸水浴中破碎后繼續(xù)加熱10 min。BCA法測定各組樣品蛋白濃度。根據(jù)試劑盒測定HK、PK、LDH和SDH的活力以及ATP含量，具體操作見試劑盒說明書和文獻[8]。

1.7 統(tǒng)計與分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件，結果均數(shù)±標準差表示，數(shù)據(jù)采用完全隨機分組設計的多樣本均數(shù)比較進行統(tǒng)計學處理，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 雷公藤紅素的濃度選擇 實驗測得，10 μg·mL-1的5-FU對A549的抑制率為48.84%。由表1可知，雷公藤紅素對A549的抑制作用較強，當雷公藤紅素的濃度在2μg·mL-1時，對A549細胞的抑制率達到62.71%，遠遠大于陽性藥組5-FU，當雷公藤紅素濃度大于2μg·mL-1時，抑制率無明顯差異，結合前期的其他細胞實驗，選用3μg·mL-1的雷公藤紅素濃度作為后續(xù)實驗的給藥濃度。

表1 雷公藤紅素對A549增殖活性影響

2.2 生長曲線法檢測細胞增殖 如圖1所示，對照組A549細胞隨時間增加，細胞濃度升高，在第6天濃度最高，與對照組比較，雷公藤紅素作用24 h細胞濃度降低，隨著雷公藤紅素作用時間的延長，細胞增殖抑制作用明顯，細胞數(shù)量逐漸減少，在第4天細胞濃度最低，第6天細胞抑制程度最明顯。

2.3 HE染色法觀察細胞形態(tài) 如圖2所示，在40×鏡下觀察，對照組A549細胞形態(tài)為梭形，而雷公藤紅素組A549細胞形態(tài)發(fā)生改變，主要體現(xiàn)為細胞邊緣變亮、形態(tài)變圓、體積減小、核深染、胞質凝集且顏色變深。

2.4 酶活力及ATP含量測定 己糖激酶、丙酮酸激酶是糖酵解中兩個重要的關鍵酶，乳酸脫氫酶可將丙酮酸轉化為糖酵解的終產(chǎn)物乳酸，決定細胞的酸性環(huán)境，雷公藤紅素組與對照組相比，乳酸脫氫酶活力顯著下降(P＜0.01)，對于己糖激酶和丙酮酸激酶活力來說，雷公藤紅素組與對照組相比沒有顯著差異(P＞0.05)，說明雷公藤紅素對己糖激酶和丙酮酸激酶作用不敏感，影響較小；對于三羧酸循環(huán)的標志酶琥珀酸脫氫酶活力來說，雷公藤紅素組顯著下降(P＜0.05)。從總體ATP含量來說，對照組和雷公藤紅素組細胞內每克蛋白中ATP含量分別為2 438.03 μmol、1 065.43 μmol，雷公藤紅素組 ATP含量顯著降低(P＜0.05)。因此雷公藤紅素能夠抑制糖酵解中的乳酸脫氫酶和三羧酸循環(huán)中的琥珀酸脫氫酶活力，進而減少ATP生成。

表2 雷公藤紅素對A549細胞HK、PK、LDH以及SDH活力的影響(U·g-1)

3 討論

腫瘤是危害人類健康的主要疾病，越來越多的研究表明許多天然中藥活性成分由于其易合成、毒副作用低、療效穩(wěn)定等特點，有望成為未來理想的抗腫瘤藥物[9]。雷公藤紅素能通過抑制蛋白酶體活性而誘導腫瘤細胞凋亡，也有強抗氧化作用和抗腫瘤血管生成作用[10]。本實驗使用雷公藤紅素處理人肺癌A549細胞，通過檢測細胞增殖和凋亡情況、能量代謝相關酶活力和代謝產(chǎn)物含量，來探究雷公藤紅素對A549肺癌細胞的增殖抑制和相關機制。

MTT結果顯示，雷公藤紅素對人肺癌細胞A549具有增殖抑制作用。當雷公藤紅素的濃度為2 μg·mL-1時，抑制率達到62.71%，高于陽性藥5-FU(10μg·mL-1)的48.84%，認為雷公藤紅素具有較強的抗腫瘤活性。但是當濃度大于2μg·mL-1時，細胞抑制率影響很小，各濃度之間抑制率無明顯變化，結合前期對血管內皮細胞HUEVC、胃癌細胞SGC-7901細胞的實驗，確定最終的給藥濃度為3 μg·mL-1。生長曲線連續(xù)6 d觀察雷公藤紅素對細胞增殖的影響，結果顯示，隨著給藥時間的延長，細胞濃度降低，具有時間依賴性，在第1天細胞數(shù)量開始下降，在第4天細胞濃度最低，在第6天抑制程度最明顯。HE染色結果表明，藥物處理后細胞數(shù)量減少，細胞形態(tài)發(fā)生變化，體現(xiàn)為細胞變圓、體積變小、胞質凝縮等，說明雷公藤紅素對A549細胞的增殖能夠發(fā)揮抑制作用。以上3種實驗結果均顯示雷公藤紅素抑制人肺癌細胞A549的增殖作用明顯。

腫瘤細胞的生長和繁殖旺盛，與普通細胞相比，所需營養(yǎng)物質的量更多。糖酵解和氧化磷酸化是細胞進行能量代謝的主要途徑，對于普通細胞來說，當氧氣充足時，葡萄糖經(jīng)徹底氧化產(chǎn)生32分子的ATP；當氧氣供應不足時，僅通過糖酵解產(chǎn)生2分子的ATP，因此只有在缺氧的條件下，正常細胞才會使用這種低產(chǎn)能的方式進行能量供應。但是在1923年，Warburg博士提出，與正常細胞相比，癌細胞內葡萄糖攝取和糖酵解速率顯著增加。高速糖酵解快速產(chǎn)生ATP，并且不再偶聯(lián)線粒體氧化代謝，產(chǎn)生的丙酮酸大多數(shù)由乳酸脫氫酶催化，在細胞質基質中轉化為乳酸。即使在氧氣充足支持線粒體呼吸的情況下，腫瘤細胞仍青睞糖酵解作為主要的產(chǎn)能途徑[11]。因此，腫瘤細胞常出現(xiàn)葡萄糖攝取量增高、糖酵解增加和乳酸堆積等現(xiàn)象。乳酸脫氫酶催化丙酮酸生成糖酵解的終產(chǎn)物乳酸，不僅為腫瘤的生長和轉移提供有利的酸性微環(huán)境，也與腫瘤耐藥性密切相關[12]，實驗結果表明，雷公藤紅素對細胞內的LDH的活力有抑制作用，抑制丙酮酸轉化成乳酸，可能會破壞腫瘤的酸性微環(huán)境。琥珀酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)的關鍵酶之一，也是線粒體的標志酶，主要催化琥珀酸生成延胡索酸并伴有能量的生成。實驗結果表明，雷公藤紅素對A549細胞內的SDH活性有顯著的抑制作用，進而對腫瘤細胞A549內的氧化磷酸化過程產(chǎn)生影響。但是雷公藤紅素對HK和PK活力無明顯影響。ATP是最主要的供能物質，腫瘤的增殖侵襲等生理活動離不開ATP。雷公藤紅素組中的ATP含量明顯下降，推測雷公藤紅素可能通過干預能量生成，進而達到抑制細胞增殖的作用。

綜上所述，雷公藤紅素可能通過影響糖酵解和氧化磷酸化過程中的酶活力，導致ATP合成減少，從而干擾腫瘤細胞能量代謝，發(fā)揮對人肺癌A549細胞的增殖抑制作用。