對一種黑木耳菌包廠發生的病害病原菌的鑒定

劉佳寧，馬銀鵬，張丕奇，馬慶芳

(黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱 150010)

0 引 言

黑木耳(Auriculariaheimuer)[1]是中國珍貴的食藥兼用真菌[2]。目前，黑木耳已成為我國栽培產量僅次于香菇的第二大食用菌品種[3]。

近年來，隨著我國食用菌產業的不斷壯大和高速發展，黑木耳的栽培模式也從單門獨戶的小作坊式生產逐漸發展到工廠化生產，我國各地的菌包生產企業從無到有逐漸發展壯大。工廠化生產出的黑木耳菌包具有生產速度快，大小、質量規格統一，菌絲培養條件和時間相近，出耳芽較齊整的特點。由于工廠內存在大量的木屑、麥麩等原材料，生產環節和環境條件又極利于雜菌生長，因此黑木耳菌包生產廠的病害防治工作就顯得極為重要，一旦爆發大規模病害將造成不可估量的損失。本研究從龍江縣及其周邊的多個黑木耳菌包生產廠采集病原菌樣品，根據科赫法則的基本步驟進行了一系列分離培養、病原菌回接和形態及分子生物學鑒定等試驗，確定了該病原菌的分類地位，為后續防治工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病害調查與病原菌菌株獲取

采集具有典型病害特征的樣品進行分離培養，獲取純病原菌菌株。該病害的典型特征為：病原菌在黑木耳菌袋內生長，萌發初期菌絲為白色或淡黃色，3～4 d后病原菌的菌落呈淡黃色或黃色。隨著病原菌菌落的不斷生長，菌落邊緣的菌絲快速生長，初期呈白色后期呈淡黃色，當病原菌全部長滿菌袋時，菌袋呈黃色。這種病害發生以后，剖開被感染的菌袋可發現，黑木耳菌絲生長緩慢，菌袋內的培養基幾乎都被病原菌占據，造成黑木耳菌絲沒有可利用的培養基而無法生長，如圖1所示。

1.2 實驗室復制病害典型特征

在黑龍江省龍江縣黑木耳菌袋生產廠場采集具有明顯病癥的標本，經分離純化后獲得純菌落，命名為未知病原菌(Unknown pathogen)。

根據科赫式法則，將分離出的病原菌與黑木耳進行回接試驗(試驗所用木耳菌為 “黑威29”，由黑龍江省科學院微生物研究所提供)，定期觀察，記錄發病情況。經過2周的培養后，黑木耳菌袋內出現了與病原地所采集樣品同樣的發病特征。

1.3 培養基配方

其一，改良PDA培養基。配方為：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g。

其二，菌袋培養基配方：木屑78%、麥麩20%、石膏1%、石灰1%。

其三，查氏酵母膏瓊脂培養基(CYA培養基)配方：酵母粉5.0 g、蔗糖 30.0 g、NaNO33.0 g、K2HPO41.0 g、KCl 0.5g、MgSO47H2O 0.5 g、FeSO47H2O 0.01 g、瓊脂15.0 g、蒸餾水 1.0 L。

圖1 不同生長時期的黑木耳病原菌菌袋Fig.1 Bags of pathogens of Auricularia auricula at different growth stages

1.4 形態鑒定

用接種針將菌袋內的病原菌菌絲挑入改良PDA培養基平板中央，置于25℃恒溫箱中培養，獲得純菌落。間隔24 h測量菌落直徑，觀察外觀形態變化及顏色等，直至菌落長滿平板為止，記錄相關數據。用接種針挑取適量培養基、菌絲及其產物，置于載玻片的無菌水中，蓋好蓋玻片后直接在顯微鏡下觀察照相并測量。

1.5 菌絲體培養及DNA提取

將菌種活化后接種于液體PD培養基中，25℃靜置培養3～5 d，收集菌絲，濾紙吸干后置于-20℃保存。采用CTAB 法提取DNA。DNA 提取物于-20℃冰箱貯藏備用。

1.6 ITS序列比對與分析

對未知病原菌(unknown pathogen)，進行ITS 序列的擴增，引物為ITS1-F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′、ITS4-：5′-CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG-3′。引物由大連寶生物有限公司合成。PCR反應在Gene Amp PCR System 9700 PCR儀上進行擴增，20 μL的反應體系內各種成分反應體系見表1，擴增程序見表2。測序由上海生物工程有限公司完成。

表1 ITS序列擴增反應體系表Tab.1 ITS sequence amplification reaction system

表2 擴增程序設置表Tab.2 Amplification program setting

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定

PDA培養基上生長迅速，25℃培養5 d菌落直徑6.9～7.2 cm，菌絲白色，產孢結構灰綠色，反面無色，無滲出液產生，無可溶性色素產生。菌絲細，具隔，分生孢子梗頂端輪軸狀分狀，排列不規則，小梗稍膨大，分生孢子串生，橢圓形。

CYA培養基，25℃，培養7 d，菌落直徑約5.6～6.8 cm，白色或中心帶有暗黃色，短絲絨狀，致密，扁平，薄，中心有短放射狀褶皺，無滲出液，無可溶性色素，反面淡黃色。產孢結構掃帚狀，分生孢子梗分枝較短。孢子囊在短分支頂部長出小梗，小梗彎曲，頂部細尖。分生孢子多數亞圓形和橢圓形，少數瓜子形，表面光滑。

圖2 未知病原菌菌落在CYA培養基上的形態Fig.2 Morphology of unknown pathogen colonies on CYA medium

2.2 序列分析

2.2.1 ITS擴增結果及分析

測序結果顯示，供試菌株ITS 序列為506 bp，如下：

菌株的ITS 序列已提交GenBank，接受號為HM383041。

2.2.2 ITS序列系統發育分析

用已經獲得的未知病原菌ITS序列在GenBank中比對，與相似度最高的6個不同種建立進化樹，6種序列名稱及GenBank號見表3：

表3 相似度較高的7個種的ITS 序列名稱及號碼表Tab.3 Seven kinds of ITS sequence names and numbers with high similarity

圖3 未知病原菌(unknown pathogen)與相似度較高的6個品種的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic trees of unknown pathogens and 6 varieties with high similarity

由圖3可知，各分枝內菌株間的最大遺傳距離較大。其中病原菌(unknown fungi)與已知種Byssochlamysspectabilis，GenBank編號KT824760.1的序列遺傳距離差異為0.0000，經比對后，其相似度為99%。結合宏觀經典分類學數據進一步確定，該病原菌為壯觀絲衣霉(Byssochlamysspectabilis)。其生物學分類為：子囊菌門(Ascomycota)、不整囊菌綱(Plectomycetes)、散囊菌目(Eurotiales)、曲霉科(Aspergillaceae)、絲衣霉屬(Byssochlamys)、壯觀絲衣霉(Spectabilis)。

3 討論

根據形態學及分子生物學方法鑒定，將病原菌確定為壯觀絲衣霉，該真菌屬于散囊菌目(又稱曲霉目或不整囊菌目)。在散囊菌目中，青霉屬、曲霉屬、絲衣霉屬內的多種真菌廣泛存在于土壤空氣和水等自然環境中，這些真菌在獲得適合的生長條件下往往可以高速生長、繁殖。在為生產黑木耳的菌包中存在大量的營養，可以被這些真菌利用。菌包生產企業如果未能在滅菌、接菌或培養等環節嚴格杜絕病原菌入侵，將會為病原菌的集中爆發提供有利條件，且在下一階段的栽培環節中，在高溫、高濕且栽培大棚通風較差的情況下，病原菌也極易生長，造成病害的大規模發生。由于黑木耳本身的生長、生殖所需要的營養、溫度、濕度、pH、水分等基礎條件與病原菌所需條件有巨大的交集，該病原菌由于生長速度極快，與黑木耳形成競爭關系，兩種真菌共同利用培養基內的營養物質，因此對該病害的防治造成較大困難，希望通過后續研究能夠找到應對該病害的合理措施。