禽流感病毒通用型熒光定量PCR檢測試劑盒比對結果分析

吳 迪,王 林,吳惠明,高曉龍,張啟龍,張 躍,劉曉冬,周德剛

(北京市動物疫病預防控制中心，北京 102629)

禽流感(avian influenza，AI)是由禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)引起的一種人與動物共患病[1]，引起禽類產生以呼吸系統疾病、產蛋下降乃至急性致死和高死亡率等為特征的烈性傳染病，給養禽業帶來重大經濟損失，家禽感染AIV后，有的不表現臨床癥狀，有的表現為呼吸道疾病和產蛋下降，嚴重的可導致全身性疾病，死亡率可達100%，而且可導致人的感染和死亡，嚴重威脅人類健康。

由于禽流感病毒高度的變異型以及新亞型病毒的出現，禽流感的防控面臨著嚴峻的考驗。高致病性禽流感暴發突然，發病率和死亡率極高，對家禽飼養業具有毀滅性打擊，世界動物衛生組織將其列為法定報告的動物疫病，中華人民共和國農業部公告第1125號對《一、二、三類動物疫病病種名錄》進行了修訂，將其列為一類動物疫病。農業農村部發布的《國家動物疫病監測與流行病學調查計劃》中規定：“對禽流感病原監測陽性個體利用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)或熒光定量PCR檢測技術進行判定[2]。”地市級動物疫病防控部門已將熒光RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)方法作為初步監測禽流感病毒的首選方法。

實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR)是一種在DNA擴增反應中,以熒光化學物質測每次PCR循環后產物總量的方法。實時熒光PCR檢測技術具有特異性強、靈敏度高、重復性好等優點，被廣泛應用于分子生物學、動物疫病研究等領域。目前，市售的國產禽流感病毒熒光定量PCR檢測試劑盒具有種類繁多，擴增片段不同，性價比高等特點，但各廠家試劑盒的敏感性、特異性和對可疑區域判定的標準不一[3-5]，導致檢測結果或Ct值(cycle threshold，指每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數)有所偏差，甚至會出現漏檢。因此，需要對不同廠家試劑盒進行科學評估，以便為實驗室采購禽流感病毒熒光定量PCR檢測試劑盒提供理論依據。為此，利用禽流感病毒標準品與臨床樣品對市售的6種品牌(分別記為A、B、C、D、E、F)禽流感病毒通用型熒光定量PCR檢測試劑盒靈敏性與特異性進行了比對，并進行了已經背景臨床樣品的檢測，篩選出禽流感病毒通用型最佳檢測試劑盒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采購北京市場上6家禽流感病毒通用型熒光定量PCR檢測試劑盒，分別用A、B、C、D、E、F表示；核酸提取試劑盒(含96孔板)購自杭州博日科技有限公司；禽流感病毒標準品H5、H7、H9亞型雞胚尿囊液由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所提供；新城疫活疫苗(clone30株)購自遼寧益康生物股份有限公司；雞傳染性支氣管炎活疫苗(H120株)購自青島蔚藍生物制品有限公司。

1.2 儀器設備

熒光定量PCR儀(美國ABI公司)、TGuide S32全自動核酸提取純化儀(天根生化科技有限公司)、移液器(德國Eppendorf公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 核酸提取

對H5、H7、H9亞型雞胚尿囊液標準品及新城疫、禽傳染性支氣管炎疫苗進行核酸提取：將室溫放置96孔板顛倒3次，去除塑封膜后在96孔板離心機中短暫離心，1 000 r/min離心5 min。避免掛液。撕去96孔上的鋁箔膜，確認板子方向(磁珠在第6與第12列中)。在96孔板的第1、第7列孔中加入200 μL樣品，避免交叉污染。將96孔板放入TGuide S32全自動核酸提取純化儀中，進行自動化反應，自動化程序結束后，將第5、第11列的洗脫液轉移至干凈的無核酸酶離心管中，得到50 μL核酸。

1.3.2 敏感性試驗

將提取的H7亞型禽流感毒核酸進行10倍倍比稀釋，從原液連續稀釋至1:108濃度，依據禽流感通用型熒光定量PCR檢測試劑盒說明書，按照說明書中提供的反應體系，擴增條件，對各個梯度的H7亞型進行實時熒光RT-PCR檢測。

1.3.3 特異性試驗

將核酸提取后的H5、H7、H9亞型RNA原液、新城疫活疫苗、雞新城疫傳染性支氣管炎活疫苗分別用6個廠家的試劑盒進行熒光定量PCR檢測，觀察是否出現擴增曲線。

1.3.4 臨床樣品檢測

利用北京市動物疫病預防控制中心保存的97份已知樣品，包括7份已知背景的滅活病毒(H7N9、H7N2、H5N1、H5N2、H5N6、H5N8、H9N2)與臨床采集保存的90份家禽泄殖腔棉拭子(已知陰性)，對A～F檢測試劑盒進行臨床檢測效果的評價。

2 試劑盒外觀及反應時長比對

2.1 試劑盒外觀比對

通過對A～F試劑盒外觀進行觀察發現，A～F試劑盒的外包裝完整，標簽粘貼完整并不易脫落，溶液清晰透明、無沉淀產生。

2.2 各廠家試劑盒反應體系與反應總時間

比對A～F試劑盒說明書，記錄反應體系與計算反應總時間。如表1所示，D試劑盒所用反應時間最短，為42 min 40 s；C試劑盒反應時間最長，為75 min。

表1 試劑盒反應體系及反應總時間Table 1 Reagent box reaction system and total reaction time

2.3 各廠家試劑盒樣本結果判定及試劑盒有效性判定區域比較

查看A～F試劑盒說明書，對各廠家試劑盒陰陽性、可疑區域判定范圍及試劑盒有效性判定結果進行比對，結果如表2所示。

表2 不同廠家試劑盒有效性判定與樣本結果判定區域Table 2 Validity judgment and sample result judgment area of kits from different manufacturers

3 結果

3.1 敏感性試驗

對樣品3次重復測定取平均Ct。由表3、圖1可知，A試劑盒最低檢出限為10-2，平均Ct為26.758，檢出限為10-3時樣品結果為可疑區域；B試劑盒最低檢出限為H7的RNA原液，在10-1濃度與10-2濃度下為可疑區域；C試劑盒最低檢出限在10-1，檢出限為在10-2內有一個樣品未檢出Ct。D試劑盒最低檢出限為10-1，在10-2濃度與10-3濃度下為可疑樣品；E試劑盒最低檢出限為10-3；F試劑盒最低檢出限為10-1，檢出限為10-2為可疑樣品。

表3 敏感性試驗Table 3 Sensitivity Test

圖1 各試劑盒靈敏度試驗結果Fig.1 Sensitivity test results of each kit

3.2 特異性試驗

由表3、圖2可知，在6種試劑盒檢測H5、H7、H9亞型RNA與試劑盒陽性對照時，均可檢出為陽性，在檢測新城疫疫苗、雞新城疫傳染性支氣管炎活疫苗時，均為陰性，無擴增曲線。在檢測H5亞型RNA時，試劑盒A的平均Ct值為15.477，試劑盒C的平均Ct值為24.885，相差9個循環數。在檢測H7亞型RNA時，試劑盒A的平均Ct值為19.353，試劑盒C的平均Ct值為27.982，相差8個循環數。在檢測H9亞型RNA時，試劑盒A的平均Ct值為18.646，試劑盒C的平均Ct值為30.41，相差12個循環數。

圖2 各試劑盒特異性試驗結果Fig.2 Specificity Test Results of each F

3.3 臨床檢測結果

用6種檢測試劑盒對實驗室保存的97份臨床樣品進行檢測。由表4可知，檢出7份陽性與90份陰性，6種禽流感病毒熒光定量PCR檢測試劑盒檢測結果一致。

4 討論

禽流感病毒亞型眾多加上基因突變、重組和重排，使其變異極快，導致毒株的致病性也千差萬別，早期快速診斷無疑是預防、控制禽流感的前提條件[6-7]。實時熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團[8]，利用熒光信號累計實時監測整個PCR進程，通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。對于熒光定量RT-PCR結果判定，多數情況下需要根據儀器噪聲情況調整閾值，閾值設定原則以閾值線剛好超過陰性對照品擴增曲線的最高點為準。一般規定陰性質控對照檢測通道讀取數據均無Ct值并且無擴增曲線，陽性質控對照檢測通道讀取數值出現特征性擴增曲線，且Ct值在某范圍內，試驗成立，否則視為試驗無效[9-10]。用的A～F試劑盒，陰陽性質控對照均滿足要求，試驗成立。

表4 97份樣品禽流感病毒熒光定量PCR檢測結果Table 4 Fluorescent quantitative PCR results of 97 samples of avian influenza virus

通過檢測不同稀釋倍數的禽流感H7亞型標準品，對試劑盒的靈敏性、特異性等指標做出了較準確的判定[11]，最終選定的E試劑盒可以作為今后試驗參考。

A～F試劑盒的比對檢測結果表明，供試的試劑盒均能準確檢測出H5、H7、H9亞型核酸，且試劑盒的特異性與敏感性良好，試劑盒的陰陽性對照均成立，結果有效。但在試劑盒敏感性方面A～F試劑盒表現各異，A、D試劑盒的可疑區間范圍較大，均為30

A～F試劑盒對陰陽性對照判定及可疑區域判定均不相同，并沒有統一的標準，分析原因可能是由于A～F試劑盒采用的擴增目的片段以及技術平臺等不盡相同[12]。當樣品Ct值落在可疑區域時，給試驗室工作人員對結果的判讀造成了較大的困擾。初步從特異性、敏感性及物理角度對6個廠家試劑盒進行分析，為今后更加科學地應用測量不確定度對熒光定量PCR試劑盒進行比對奠定了基礎[13]。

5 結論

從試劑盒外觀、反應時長、樣本結果判定及有效性判定區域進行比較，并由敏感性與特異性試驗、臨床樣品檢測試驗結果綜合考慮，得出以下結論。E試劑盒外包裝完整，試劑管內液體清晰，反應時長為60 min,最低檢出限為10-3,特異性良好。因此，E試劑盒要優于其他廠家試劑盒，更適用于臨床檢測篩選。