片球菌素的來源、生物合成、抑菌機理及其構效關系的研究進展

王祺，張軍，喬曉妮，何增國,2*

1(中國海洋大學 醫藥學院，山東 青島，266003) 2(青島百奧安泰生物科技有限公司，山東 青島，266100)

李斯特菌(Listeriaspp.)是一種導致食物腐敗變質的常見微生物[1]。其中，單核增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)更會引起動物和人類的疾病[2]。據世界衛生組織統計，4%～8%的水產品、5%～10%的乳及乳制品以及30%以上的肉類被李斯特菌污染[3]。人和動物誤食被該菌污染的食品后，會引起嚴重的食物中毒[4]。據報道，美國每年有1600多例單核增生李斯特菌感染人的病例，死亡率高達12.5%[5]。雖然四環素、甲氧芐啶和青霉素對治療單核增生李斯特菌中毒的效果顯著，但在食品工業中，仍然缺乏安全防止單核增生李斯特菌污染的有效手段[6]。

細菌素是一種來源于細菌的由核糖體合成具有抗菌功能的小肽，因具有安全性高、穩定性好、無殘留等特點，在食品防腐領域日益受到關注[7]。乳酸菌是公認安全的(generally recognized as safe，GRAS)益生菌，其產生的細菌素更成為了食品防腐領域的研究熱點[8]。其中，乳酸鏈球菌(Streptococcuslactis)代謝產生的細菌素——乳酸鏈球菌素(nisin)可有效地抑制腐敗菌的生長、延長食品的保質期，已經在食品防腐領域應用達半個多世紀[9]。細菌素按照結構、分子量、熱穩定性以及是否經過翻譯后修飾等特點，主要分為3類(表1)。其中，IIa類細菌素也稱類片球菌素，具有強烈的抗李斯特菌活性[10]，其中以片球菌素(pediocin)最具代表性。片球菌素具有良好的熱穩定性和廣泛的pH適應性，能夠滿足苛刻的食品加工環境，因此在食品防腐領域，特別是防止李斯特菌污染方面，成為了繼nisin之后，細菌素研究領域又一熱點[11]。

表1 細菌素的分類Table 1 Classification of bacteriocins

1 片球菌素的來源及序列特征

迄今為止，已發現的片球菌素共18個(表2)，來源包括：乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceous)和有害片球菌(Pediococcusdamnosus)。片球菌素分子質量一般在2～10 kDa之間，其序列中氨基酸殘基數量差異較大，從37～48個不等(除前導肽外)，但其序列中均含有4個Cys，形成2對二硫鍵。如表2所示，片球菌素序列的凈電荷數均為正值，這與其發揮抑菌功能直接相關。片球菌素一般在微克級別均有抑菌活性，且均表現出對單核增生李斯特菌具有強烈的抑制作用。

表2 片球菌素的種類及序列特征Table 2 Types and sequence characteristics of pediocin

續表2

名稱來源氨基酸殘基個數序列特征凈電荷數敏感菌最小抑菌濃度分子質量/kDa參考文獻pediocin 5Pediococcus acidi-lactici UL5-----[21]pediocin CP2Pediococcus acidi-lactici MTCC 5101---Listeria monocytogenesPseudomonas aeruginosa-3[22]pediocinPediococcus acidi-lactici 13-----5.5[23]pediocin JDPediococcus acidi-lactici JD123---Listeria monocytogenes--[24]pediocin PCPediococcus acidi-lactici PC---Listeria monocytogenes--[25]pediocinNCDC252Pediococcus acidi-lactici NCDC252--Listeria monocytogenesStaphylococcus aureus--[26]pediocinCFR B19Pediococcus pen-tosaceus CFR B19---Listeria monocytogenes-4.8[27]pediocin ST65ACCPediococcus pen-tosaceus ST65ACC---Listeria monocytogenes--[28]pediocinPP-SIIIPediococcus pen-tosaceus CFR SIII---Listeria monocytogenesSalmonella paratyphiStaphylococcus aureus-5[29]

2 片球菌素的生物合成

片球菌素的合成基因由質粒編碼，其合成和分泌相關的4個基因位于同一操縱子[30]，包括：(1)結構基因(structural genes)，用于編碼片球菌素前體；(2)免疫基因(immunity genes)，用于編碼保護片球菌素產生菌免受其自身殺死的免疫蛋白；(3)ABC轉運蛋白系統基因(ATP-bindingcassette transporter system genes)，用于編碼與細胞膜相關的ABC轉運蛋白系統，該系統將片球菌素轉移到細胞膜上，同時去除片球菌素前體的前導序列；(4)輔助蛋白基因(accessory protein genes)，用于編碼片球菌素分泌所必需的輔助蛋白。

與眾多細菌素的合成類似，片球菌素的生物合成同樣受群體感應(quorum sensing，QS)系統調控，主要表現在細菌素表達量與細胞密度或環境壓力正相關[31]。這一過程受3組分系統調控[7]，即(1)誘導因子(inducer factor, IF)；(2)膜組氨酸蛋白激酶(member histidine protein kinase, MHK)；(3)響應調節因子(response regulator, RR)。首先，IF在基礎水平上進行組成型表達，并通過ABC轉運蛋白系統分泌到細胞外，當釋放到細胞外的IF濃度足夠高時，會結合到跨膜的MHK上，使其位于細胞質一側自磷酸化。之后，這個磷酸基被轉移到RR，并激活RR。最后，活化的RR與片球菌素結構基因上的啟動子結合，啟動片球菌素基因的表達。其中，IF在片球菌素生物合成過程作為正反饋因子，促進其自動調節機制(圖1)。

圖1 片球菌素的生物合成示意圖(ChemBioDraw Ultra 14.0軟件繪制) Fig.1 Schematic diagram of biosynthesis of pediocin(drawed by ChemBioDraw Ultra 14.0)

片球菌素基因表達的特點主要在于其N端有一段前導肽。該前導肽可使片球菌素前體與ABC轉運蛋白系統有效互作。然后，在成熟的片球菌素分泌到胞外前，前導肽在細胞質側被ABC轉運蛋白系統的附屬蛋白降解。此外，與其他細菌素的前體通常不具活性相比，連接前導肽片段的片球菌素前體具有明顯的抑菌活性[32]。因此，為了避免片球菌素對產生菌的抑制作用，片球菌素合成后會被迅速運輸到胞外(圖1)。然而，前導肽的作用僅為輔助片球菌素分泌，對結構域的形成和抑菌功能的實現并沒有作用。RAY等[32]將pediocin AcH前體肽和成熟肽分別進行異源表達，結果發現pediocin AcH前體肽的抑菌活性約為成熟肽的80%，這表明前導肽對pediocin AcH成熟結構域的形成和抑菌作用幾乎沒有影響。

3 片球菌素的抑菌機理

3.1 正確構象的形成

分泌到細胞外的片球菌素需要在特定環境條件下才能形成正確構型。研究發現，類片球菌素sakacin P在水或二甲基亞砜溶液中均以無規卷曲存在，不能正確折疊[33]。片球菌素正確折疊通常依賴于細胞膜或與細胞膜類似的環境。CASTANHO等[34]利用十二烷基磷酸膽堿(DPC)膠束和三氟乙醇(TFE)溶液模擬細胞膜環境，使用核磁共振波譜法分析2種類片球菌素在該環境下的三維結構，結果顯示，N端形成含有二硫鍵的三股反平行β-折疊，同時C末端折回至中心α-螺旋上，形成含有發夾狀結構的正確構型。這種受細胞膜或類細胞膜環境催化的折疊方式，拉近了帶正電荷氨基酸殘基的空間位置，為細菌素更好的與靶細胞膜結合提供了高效的構象基礎。

3.2 N端與細胞膜的吸附結合

形成正確構型的片球菌素，通過N端β折疊結構域與目標菌株的細胞膜相互結合。首先，該結構域中帶正電荷氨基酸殘基通過非特異性的靜電引力與靶細胞膜上帶負電荷的磷脂基團相互作用，使片球菌素的親水部分固定于細胞膜上[35]。因此，β折疊結構域帶中正電荷氨基酸殘基的聚集區越多，片球菌素對靶細胞膜的親和力和結合力越強[36]；隨后，該結構域與靶細胞膜上的甘露糖磷酸轉移酶系統(mannose phosphotransferase system, man-PTS)結合，錨定在細胞膜上[37]。

3.3 C端向膜內插入

片球菌素錨定于細胞膜上后，其C端疏水性螺旋自然向細胞膜中間的疏水性區域插入，而C端區域插入的具體位置，由靶細胞膜上man-PTS的ⅡC和ⅡD亞基決定。首先，C端螺旋結構在片球菌素插入靶細胞膜時可作為跨膜組分起作用，即疏水螺旋穿入靶細胞膜的疏水核心。隨后，特異性結合man-PTS的ⅡC和ⅡD亞基，導致細胞膜穿孔[38]。在膜穿孔過程中，片球菌素與II C亞基特異性結合形成片球菌素-II C復合物，而II D亞基起到穩定該復合物結構的作用。KJOS等[39]在大腸桿菌中對單核增生李斯特菌的man-PTS的ⅡC和ⅡD亞基進行異源表達后發現，ⅡC亞基單獨表達時和ⅡC和ⅡD亞基共表達情況下，其對片球菌素敏感，且敏感性后者是前者的2倍，而當對ⅡD亞基單獨表達時，大腸桿菌對片球菌素不敏感。因此，穩定的片球菌素-IIC復合物的形成，對片球菌素抑菌功能的實現起到至關重要的作用。

3.4 在細胞膜上穿孔形成孔洞

片球菌素在靶細胞膜上形成孔洞后，直接導致胞內鉀離子、氨基酸等小分子物質外泄，使跨膜細胞質子動能勢(proton-motive force, PMF)喪失。MANDAL等[2]利用800 AU/mL的pediocin NV5對單核增生李斯特菌處理30 min后發現，溶液中鉀離子濃度提高7.5倍。然而，片球菌素作用于敏感細胞膜形成的孔洞直徑較小，ATP和蛋白質等大分子物質會被截留在胞內，PMF的喪失加速了胞內ATP的消耗，導致細胞凋亡[40]。

4 片球菌素的構效關系

Ⅱa類細菌素是以片球菌素的結構為基礎歸類的，其一級結構通常包含37～48個氨基酸殘基，親水的陽離子N端區域含有1個保守的片球菌素框(pediocin box)區域，包含-YGNGV-基序[41-42]。二級結構中N端區域通常形成β-折疊結構域，C端結構域由1～2個α螺旋組成兩親性或疏水性結構。三級結構中C端通常以一個結構延伸的尾部折疊形成發夾狀，在β折疊的N末端區域和發夾狀C末端區域之間有1個柔性鉸鏈，可使2個結構域之間實現相對移動[43]。大多數Ⅱa類細菌素N端均存在一對二硫鍵，對維持N端的兩親性結構和β折疊結構域的穩定具有重要作用(圖2)。

圖2 pediocin PA-1(PDB ID: 5UKZ)的三級結構(使用SPDV4.10軟件生成) Fig.2 Tertiary structure of pediocin PA-1 (PDB ID: 5UKZ)

與Ⅱa類細菌素不同的是，片球菌素通常在其C端存在另一個二硫鍵，這使得片球菌素相對于其他Ⅱa類細菌素結構更加穩定[38-44]。FIMLAND等[45]發現，同為Ⅱa類細菌素，C端含二硫鍵的pediocin PA-1與C端不含二硫鍵的sakacin P相比，雖然在20 ℃的條件下抑菌活性相同，但在37 ℃條件下，前者的抑菌活性為后者的10倍。

4.1 C端區域

C末端α螺旋結構對片球菌素發揮抑菌功能起著決定性作用，因此對該區域序列中的關鍵氨基酸殘基進行替代研究，可以有效提高片球菌素的抑菌功能。FIMLAND等[46]通過組合不同IIa類細菌素N端和C端區域，形成系列雜合細菌素。通過抑菌實驗發現，C末端相同的雜合肽其抑菌功能大體相同，而N末端相同的雜合肽抑菌活性差異巨大；C末端的抑菌活性與其氨基酸殘基組成直接相關。SUN等[47]通過對pediocin PA-1 C末端區域中8個氨基酸殘基進行突變，結果顯示，用疏水性氨基酸殘基Ala取代第29位的Gly后，抑菌活性有非常明顯的增加；HAUGEN等[48]利用帶負電荷的氨基酸殘基Asp替換pediocin PA-1 C末端一半螺旋區的片段中的所有殘基，結果表明，第20位的Lys被替代后，片球菌素抑制活性有明顯的降低。因此，疏水性和帶正電荷的氨基酸殘基，與C末端發揮抑菌作用直接相關。

4.2 N端區域

N端區域直接參與片球菌素與靶細胞膜結合。因此，對該區域序列中的關鍵氨基酸殘基進行替代研究，可使片球菌素與靶細胞更有效的結合，而更高的結合效率通常意味著發揮抑菌作用需要的濃度更低。SONG等[49]對pediocin PA-1 N端正電荷氨基酸殘基進行插入和替代研究，結果發現，將其N端第0位插入1個帶正電荷的Lys，同時將第13位的Ser替換為Lys后，片球菌素突變體對靶細胞的親和力升高，且對單核增生李斯特菌的抑菌濃度降低了50%，而在N端第10位的Gly替換為Lys后，片球菌素變體對靶細胞的親和力降低，其抑菌濃度增加了10倍之多。因此，增加片球菌素N端特定位置帶正電荷氨基酸殘基，對其發揮抑菌功能具有提升作用。

4.3 ABC轉運蛋白和輔助蛋白

ABC轉運蛋白是保證片球菌素向胞外分泌的關鍵。該蛋白由約700個氨基酸殘基組成，參與前導肽切割和成熟片球菌素向胞外分泌。因此，其結構穩定性對其發揮轉運功能至關重要，二硫鍵通常具有維持蛋白結構穩定性的作用。OPPEG?RD等[50]用Ser替代pediocin PA-1 ABC轉運蛋白的Cys，結果顯示pediocin PA-1向胞外的分泌被完全抑制。這表明ABC轉運蛋白結構的穩定對其發揮轉運片球菌素的功能至關重要。

片球菌素通常具有1～2對二硫鍵，輔助蛋白通常參與片球菌素二硫鍵的形成。輔助蛋白通常包含170個氨基酸殘基，其N端依靠2個Cys形成的1對二硫鍵維持結構穩定。HAVARSTEIN等[51]分別用Ser替換pediocin PA-1輔助蛋白中的2個Cys，結果發現，取代第86位Cys后形成正確二硫鍵pediocin PA-1的數量減少到之前的1/2，而取代第83位Cys后形成正確二硫鍵連接的pediocin PA-1幾乎完全消失。因此，輔助蛋白參與片球菌素二硫鍵的形成過程，同樣依賴于其結構的穩定性。

5 展望

近年來，生物防腐劑受到了越來越多的關注[52]。片球菌素作為一種高效、安全、無毒、無殘留的天然防腐劑，符合未來食品防腐領域的發展需求。片球菌素可強烈且專一抑制食物腐敗菌——李斯特菌，其較窄的抗菌譜可能意味著更強的靶向性且對人體微生態的平衡影響更小。目前，已知的片球菌素產生菌均為GRAS菌，即公認的安全性菌種。片球菌素優良的熱耐受性使其可被廣泛的用于需經熱處理的食品，而其廣泛的pH耐受性，有效彌補了目前唯一商業化細菌素nisin僅存在于低pH值條件下的不足。片球菌素無毒、無色、無味，這些特點使其在食品領域發揮防腐作用的同時，不影響食物的風味，而蛋白屬性又決定了其可被腸道內的胰蛋白酶等降解，因此不必擔心殘留和環境釋放問題。未來，片球菌素作為食品添加劑大規模應用于食品工業，還有待于以下方面研究的進展：(1)高產片球菌素菌株的選育；(2)片球菌素專一性抑制李斯特菌機理的闡明；(3)利用分子手段，優化片球菌素序列結構，提高抗菌活性；(4)探索片球菌素在不同的食品加工環境和工藝下的應用效果。同時，開展片球菌素與其他防腐手段，如高流體靜壓或脈沖電場等協同作用的抑菌效果研究，也將拓寬其應用范圍。相信隨著相關研究的不斷深入，片球菌素在食品領域，防止李斯特菌侵染方面將發揮重要的作用。