QuEChERS凈化-超高效液相色譜-串聯質譜法測定凱特芒果中14種農藥殘留

田金鳳,尚遠宏

(攀枝花學院 醫學院，四川 攀枝花，617000)

芒果(MangiferaindicaLinn.)是漆樹科杧果屬的多年生植物[1]，其果實享有熱帶果王之稱[2-3]。目前，攀枝花市的芒果上市時間較國內其他產區晚2～3個月，凱特芒果種植總面積在全市芒果種植中接近70%[4]，且凱特芒果作為晚熟品種占比最大[5]，具有較強的市場競爭力。同時，中國是世界最大芒果消費國和主要生產國，但我國芒果農藥種類和農藥殘留標準指標少，針對性不強[6]；隨著進出口貿易逐年加大，如何使國家在制修訂農藥殘留標準時，既符合貿易國的芒果進出口的規定，又要保護國內芒果生產，高度重視芒果質量安全問題變得非常重要。

我國芒果主要分布在海南、臺灣、四川和廣東等熱帶亞熱帶地區，該地區具有高溫高濕的氣候特點，且芒果缺乏優良的抗病品種[7]，使得在芒果上發生的病蟲害較為普遍。芒果生產過程中農藥施用不合理，造成芒果產品農藥殘留問題日益凸顯，導致其安全性和食用性均受到影響。2020年2月15日將正式實施的GB 2763—2019中，規定芒果專屬的農藥27種(表1)[8]，包含11種殺蟲劑，14種殺菌劑和2種植物生長調節劑。標準中，除芒果專屬的農藥(1種殺菌劑“咪鮮胺和咪鮮胺錳鹽”及1種殺蟲劑“氰戊菊酯和S-氰戊菊酯”)之外，有“皮不可食的熱帶和亞熱帶水果”要求的芒果非專屬(間接)的農藥47種，含44種殺蟲劑和3種除草劑。目前，我國尚未對三唑酮、丙環唑、嘧霉胺、甲霜靈、烯酰嗎啉、惡霜靈、腈菌唑等7種殺菌劑和氧樂果、克百威、三羥基克百威3種殺蟲劑在芒果中殘留限量做出規定，也無對其殘留測定的標準方法。因此，探討并建立同時檢測芒果中14種農藥殘留標準具有實際意義。

表1 中國的芒果專屬的農藥殘留標準限量Table 1 Maximum residue limits(MRL)to pesticides in mango of China

注：*表示該限量為臨時限量

目前，現行國家標準 GB/T 20769—2008有水果和蔬菜中農藥殘留量分析的液相色譜-串聯質譜檢測方法，但該方法前處理操作繁瑣、成本高、費時費力，不適合大批量樣品的快速定性及定量分析[9]。而國內外也有利用氣相色譜法和液相色譜法等方法檢測芒果中農藥殘留的報道[10-12]，常采用傳統的固相萃取或液液萃取的前處理凈化方法，存在操作繁瑣、消耗時間長等不足，不適用于高通量檢測芒果中農藥殘留。同時，芒果的基質成分復雜，特別是攀枝花的凱特芒果甜度高、含糖量大，分離分析難度大，檢測干擾嚴重。尚未見同時檢測凱特芒果中多菌靈、三唑酮、戊唑醇、丙環唑、嘧霉胺、甲霜靈、烯酰嗎啉、苯醚甲環唑、惡霜靈、腈菌唑、吡唑醚菌酯等11種殺菌劑和氧樂果、克百威、三羥基克百威3種殺蟲劑的殘留報道。高通量檢測蔬菜及水果中農藥多殘留的最有效和快速的前處理凈化方法是QuEChERS法[13]。QuEChERS技術具有快速、高效等優點，被廣泛運用于農藥殘留分析的前處理過程中。液相色譜-串聯質譜法具有高通量、高選擇性和高靈敏度等特點，是農藥殘留分析的熱點技術之一[14-15]。但QuEChERS方法在結合液相色譜-串聯質譜儀分析時，樣品提取溶劑及量的變化會造成環境污染和溶劑效應，本文對提取溶劑、體積和提取次數進行優化，提高了方法的適用性。

食品中農藥最大殘留限量新標準的實施，對于芒果農殘檢測的數量增多和限量要求越來越嚴格，因此通過有效的技術手段，對芒果中的有關藥物殘留進行檢測，以確保人類對芒果消費的安全，具有十分重要的意義。本文以凱特芒果為研究對象，優化了QuEChERS前處理條件、色譜條件和質譜條件等，采用超高效液相色譜-串聯質譜法測定凱特芒果中14種農藥殘留，其方法準確可靠，操作簡易，回收率穩定，能滿足日常凱特芒果農藥殘留的檢測要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

凱特芒果，攀枝花地區市售或采摘晚熟凱特芒果；甲酸、甲醇(色譜級) Fisher公司；農藥標準品：多菌靈、嘧霉胺、甲霜靈、烯酰嗎啉、三唑酮、戊唑醇、丙環唑、苯醚甲環唑、氧樂果、克百威、三羥基克百威、惡霜靈、腈菌唑、吡唑醚菌酯，純度均大于98%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH；其他試劑為國產分析純。

Agilent 6460A超高效液相色譜-串聯四級桿質譜儀，美國Agilent 公司；1-14k離心機，Sigma公司；FA2014B電子天平，上海越平公司；Milli-Q IQ7000超純水器，美國Millipore公司；VORTEX 4渦旋混合器，LMS公司；NEVAP-45氮吹儀，美國Organomation公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

分別準確稱取適量14種標準品，分別用甲醇溶解并配制成1.0 mg/mL的標準儲備液，-20 ℃避光保存。其他濃度標準溶液用甲醇定量稀釋即得。

1.2.2 樣品前處理

芒果去皮去核取可食用部分，稱取10.0 g芒果樣品(精確至0.01 g)于50 mL聚丙烯刻度離心管中，加入10 mL體積分數0.5%甲酸乙腈溶液[16]，振蕩渦旋20 min，加入NaCl 1 g和無水MgSO45 g[17]，立即渦旋混勻10 s，然后10 000 r/min離心5 min，取上清液5.0 mL，加入QuEChERS試劑管中渦旋混勻1 min，再10 000 r/min離心3 min，取上清液0.5 mL，用水定容至1 mL，混勻后14 000 r/min離心5 min，過0.22 μm濾膜，即得。

1.2.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相4 mmol/L甲酸水溶液-甲醇[18]，梯度洗脫；流速0.2 mL/min；進樣體積2 μL；柱溫30 ℃；洗脫方式:梯度洗脫，洗脫程序0～7.5 min，甲醇由體積分數30%升至90%；7.5～10 min，甲醇為90%；10～10.5 min，甲醇由90%降至30%；10.5～15 min，甲醇為30%。

質譜條件：離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式多反應監測(multiple reaction monitoring, MRM)；霧化氣壓力45 psi；輔助氣流速11 L/min；輔助氣溫度300 ℃；電噴霧電壓4 000 V。

14種農藥的多反應監測質譜參數見表2。

表2 多反應監測模式下14 種農藥的質譜參數Table 2 MS conditions under MRM mode of the 14 pesticide residues

1.2.4 方法的標準曲線、線性范圍及檢出限

配制好的 14種農藥標準儲備液用甲醇稀釋成400 μg/L混合標準溶液，用空白芒果基質提取液將混合標準溶液稀釋成200、100、80、40、20、10、4 μg/L系列質量濃度的混合標準溶液分別進行測定。以質量濃度為橫坐標，定量離子峰面積為縱坐標，采用外標法建立標準曲線。以3倍信噪比(S/N≥3)和10倍信噪比(S/N≥10) 分別確定檢出限(limit of detection, LOD)與定量限(limit of quantitation, LOQ)[19]。

2 結果與分析

2.1 色譜和質譜條件優化

實驗對比ZORBAX-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)和核殼柱Poroshell 120 EC- C18(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)，分別對14種質量濃度為100 μg/L的目標化合物進樣，優化其色譜和質譜條件。結果顯示，使用ZORBAX-C18柱適用性好，出峰均勻，峰形尖銳，分離度好；而流動相中加入少量酸能夠達到改善峰形、提高分離效率的作用，并且化合物更容易離子化，提高靈敏度；同時，在子離子掃描模式下，優化碰撞能量，得到相應的離子碎片。14種農藥的MRM色譜圖見圖1，二級離子質譜圖見圖2。

圖1 100 μg/L混合標準溶液的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of 100 μg/L mixed standardsolution

圖2 14種農藥的二級離子質譜圖Fig.2 MS /MS spectra of the 14 pesticide residues注：a～n分別對應表2中1～14農藥

2.2 提取條件的優化

樣品前處理參照文獻[16]方法適當改進，分別采用8、10、12 mL 0.5%甲酸乙腈和乙腈溶液提取進行比較，結果發現14 種農藥經10 mL 0.5%甲酸乙腈溶液提取1次效果最好，而且提取次數的增加并不會引起提取率顯著提高，達到節約試劑和減少環境污染，且用乙腈溶液提取比0.5%甲酸乙腈提取的雜質多。同時，樣品前處理過程中用無水MgSO4和NaCl作為除水劑，NaCl加大水中的離子強度，因鹽析作用將樣品中水層和有機試劑乙腈層分離，而無水MgSO4和水分子結合來起到除水作用。

2.3 方法的線性關系及檢出限

14種農藥的線性回歸方程、相關系數、線性范圍及檢出限見表3。14種農藥在4.0～200.0 μg/L線性范圍內的相關系數均>0.999，LOQ為0.15～1.0 μg/kg，均低于中國和歐盟規定的最大殘留限量值[6]。同時，食品安全國家標準的檢測方法中含14種農藥殘留以適用于“芒果”、“其他食品”或“其他蔬菜和水果”可參照執行的檢測方法相比，GB 23200.8—2016中規定甲霜靈的LOQ為0.037 6 mg/kg、三唑酮為0.025 0 mg/kg、腈菌唑為0.012 6 mg/kg、丙環唑為0.037 6 mg/kg、惡霜靈為0.012 6 mg/kg、戊唑醇為0.037 6 mg/kg[20]；GB 23200.34—2016中吡唑醚菌酯和3-羥基克百威的LOQ均為0.005 mg/kg[21]；GB 23200.49—2016中苯醚甲環唑的LOQ為0.005 mg/kg[22]；NY/T 1453—2007中多菌靈的LOQ為0.02 mg/kg[23]；SN/T 0519—2010中丙環唑的LOQ為0.01 mg/kg[24]；GB 23200.46—2016中腈菌唑的LOQ為0.01 mg/kg[25]。均比本文中14種相應農藥的殘留LOQ規定值大。本方法具備了更靈敏的定量檢測能力，解決了芒果中農藥檢測的問題，對芒果的農殘檢測具有一定專屬性，能滿足凱特芒果中14種農藥殘留檢測的要求。

表3 14種農藥的線性范圍、回歸方程和相關系數Table 3 Linear regression equations, correlation coefficients and detection limits of 14 pesticides

注：克百威及3-羥基克百威之和，以克百威表示殘留物

2.4 方法的回收率與精密度

以5、20、100 μg/kg的水平將14種農藥添加到空白凱特芒果基質中，測定回收率，結果見表4。

表4 14種農藥的添加回收率和相對標準偏差(n=6)Table 4 Spiked recoveries and relative standard deviations(RSD) of the 14 pesticides (n=6)

續表4

序號組分名添加水平/(μg·kg-1)回收率/%RSD/%9三唑酮5, 20, 10092.5, 94.9, 98.35.8, 6.9, 8.310腈菌唑5, 20, 10087.7, 91.8, 94.14.1, 5.5, 6.311戊唑醇5, 20, 10090.4, 94.8, 98.14.8, 5.9, 8.912丙環唑5, 20, 10088.5, 96.8, 103.16.1, 9.7, 11.213吡唑醚菌酯5, 20, 10086.9, 93.6, 98.35.1, 6.9, 7.814苯醚甲環唑5, 20, 10094.2, 98.8, 100.45.3, 8.6, 9.8

14種農藥在凱特中的回收率范圍為86.5%～103.1%，相對標準偏差為4.1%～11.5%，回收率與精密度滿足農藥定量分析要求[26]。

3 結論

本文結合固相萃取技術，以高效液相色譜-串聯質譜法建立了凱特中14種農藥殘留的分析測定方法。該方法前處理操作簡單，凈化效果好，靈敏度高，干擾少，其LOQ 可達到0.15 μg/kg，凱特芒果樣品中14 種農藥均未檢出，在實際檢測中具有較強的可行性和實用性，也適用于芒果各品種中14種農藥殘留的定性和定量分析，且對于即將實施的GB 2763—2019標準的完善芒果中多種農藥殘留的檢測方法和限量標準的制定是十分必要的。