固定化酶制備鳀魚蒸煮液蛋白肽及其性能表征

馬瑞娟，林煌華，謝友坪*，陳劍鋒

1(福州大學，海洋生物高值高質化利用技術創新服務平臺，福建 福州,350108) 2(福州大學，福建省海產品廢棄物綜合利用工程技術研究中心，福建 福州,350108) 3(福州大學，福州市海產品高值化利用行業技術創新中心，福建 福州,350108)

鳀魚已經成為世界上捕撈量最大的小型魚種，年產量達到9 000萬t[1]。鳀魚蒸煮液富含蛋白質、氨基酸、微量元素、牛磺酸等營養物質[2]，但是目前這些蒸煮液大部分被直接排放，造成了一定程度的資源浪費和環境污染。

蛋白肽的分子質量位于大分子蛋白質和氨基酸之間，具有分子量小、易吸收、水溶性佳、穩定且安全等優點，廣泛應用于食品、飼料及肥料中。WASSWA等[3]利用堿性蛋白酶制備草魚皮蛋白肽；ALEMN等[4]從金槍魚和大比目魚皮明膠中制備小分子蛋白質；SAMPATH KUMAR等[5]利用胃蛋白酶、胰蛋白酶和食糜蛋白酶從馬鮫魚和黃花魚的皮膚中提取獲得蛋白質水解肽。目前，國內關于利用蒸煮液制備活性蛋白肽的相關研究還鮮有報道。

磁性交聯酶聚集體(magnetic cross-linked enzyme aggregates)技術是一種相對較新的酶固定化方法，主要是將交聯酶聚集體(cross-linked enzyme aggregates, CLEAs)附著在氨基功能化磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles，MNP)上[6]。將這種氨基官能化的磁鐵礦納米顆粒添加到具有低賴氨酸殘余物含量的酶溶液中可以制備出高穩定性的CLEAs。此外，由于磁鐵礦納米顆粒的磁性，通過外部施加磁場能將CLEAs與其反應混合物分離，可實現蛋白酶的重復利用[7]。

本研究制備了磁性中性蛋白酶CLEAs和磁性堿性蛋白酶CLEAs，并以鳀魚蒸煮液作為原料，利用固定化酶制備蛋白肽。在單因素試驗的基礎上運用中心組合設計法優化酶解工藝，并對酶解液蛋白肽的氨基酸組成、分子量分布和抗氧化活性進行分析，同時考察固定化酶的重復利用性。本研究可為促進魚類資源高值化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鳀魚蒸煮液，福州海匯生物科技實業有限公司；堿性蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；中性蛋白酶，北京奧博星生物技術有限責任公司；乙腈、甲醇均為色譜純，國藥集團化學試劑有限公司；2,2-聯苯基-1-苦基肼基，上海麥克林生化科技有限公司；FeSO4·7H2O，西隴化工股份有限公司；3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，上海麥克林生化科技有限公司；三氟乙酸、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、無水乙醇、正丙醇、NaOH、三氯乙酸、鄰苯三酚、水楊酸等均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SP-756P紫外分光光度計，上海光譜儀器有限公司；Sartorius BS 210S電子天平，德國Sartorius公司；Biochrom30+全自動氨基酸分析儀，英國biochrom公司；LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津公司；ZNCL-TS智能磁力攪拌器，上海越眾儀器設備有限公司；THZ-82恒溫水浴振蕩器，常州國華電器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 磁性CLEAs的制備和重復利用

MNP的制備和修飾參考AKHOND等[8]和BEDADE等[9]報道的方法。將1.33 g FeSO4·7H2O和2.59 g FeCl3·6H2O溶解在100 mL去離子水中，用氮氣流除去氧氣使其產生惰性條件。之后加入6.0 mL氨水(25%質量分數)攪拌30 min，收集沉淀物，用去離子水(3次)和乙醇(1次)洗滌，即得MNP。將1.38 g MNP懸浮在50 mL乙醇(50%體積分數)中，超聲處理30 min后滴加5.55 mL APTES，并在1 000 r/min、50 ℃下回流3 h進行MNP修飾。然后在25 ℃條件下8 000 r/min離心10 min，收集沉淀物用去離子水(3次)和乙醇(1次)洗滌，即得修飾化的MNP，干燥備用。

磁性CLEAs的制備：稱取5 mg中性蛋白酶和10 mg堿性蛋白酶，分別用1 mL磷酸緩沖液(pH分別為 7.5、10.5)溶解，加入5 mg修飾化的MNP，混勻。之后加入9 mL乙醇，置于4 ℃冰箱，待蛋白酶完全沉淀后加入體積分數0.2%戊二醛溶液，于4 ℃交聯4 h。最后使用磁鐵吸附磁性CLEAs，倒掉上清液，凍干備用。

磁性CLEAs的重復利用：待酶解反應結束后，利用磁鐵將磁性CLEAs吸附，使其從反應體系中分離，隨后使用磷酸緩沖液(pH為7.8)洗滌3次，以用于下一次酶解反應。

1.3.2 TCA-NSI測定

以三氯乙酸氮溶解指數(trichloroacetic acid-nitrogen soluble index，TCA-NSI)為酶解效率的評價指標，參考鄭志強[10]報道的TCA方法，測定酶解液中多肽得率，按公式(1)計算：

(1)

式中：m0，15%TCA中可溶性氮質量，mg；m1，原料中總氮質量，mg。

可溶性氮質量的測定參照雙縮脲法[11]，總氮質量的測定參照GB 5009.5—2016的凱氏定氮法。

1.3.3 氨基酸組成測定和必需氨基酸指數(essential amino acid index, EAAI)的計算

參照國標GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》測定氨基酸組成。

EAAI計算如公式(2)所示[12]：

(2)

式中：aan，樣品中必需氨基酸質量占總蛋白質量的比例；AAn，FAO/WHO參考標準中必需氨基酸質量占總蛋白質量的比例[13]。

1.3.4 酶解液分子質量分布

參照GB/T 22729—2008。

1.3.5 抗氧化活性研究

1.3.6 酶解工藝優化

1.3.6.1 酶解工藝單因素試驗

酶解單因素試驗的基本條件為：底物質量濃度100 g/L、溫度54.5 ℃、酶解時間1 h、pH 8.2。在此基礎上考察以下單因素的酶解效果：底物質量濃度(40、70、100、200、400 g/L)、酶質量濃度(0.5、1、2、3、4、5、6 g/L)、溫度(24.5、34.5、44.5、54.5、64.5、74.5 ℃)、pH(5.2、6.2、7.2、8.2、9.2、10.2)、時間(5、15、30、45、60、90、120 min)、堿性蛋白酶和中性蛋白酶質量比例(4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)。每個因素梯度設置3次平行試驗。

1.3.6.2 酶解工藝響應面試驗

利用Design-Expert 8.0.6軟件，根據Box-Benhnken中心組合的試驗設計原理，將溫度、pH、復合酶比例作為試驗因素，以TCN-NSI為響應值，設計三因素三水平的分析試驗(表1)，考察固定化酶法制備鳀魚蒸煮液蛋白肽的最佳工藝組合條件。

表1 中心組合試驗自變量因素和水平Table 1 Independent variables and their levels usedin the response surface design

1.3.7 數據分析

實驗結果由平均值±SD 表示。采用IBM SPSS Statistics 24.0 軟件分析數據之間的顯著性，P<0.05說明數據之間具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 酶解工藝單因素試驗

前期研究表明，利用游離態的堿性蛋白酶與中性蛋白酶酶解鳀魚蒸煮液的效果最佳[17]。基于此，本研究進一步考察固定化堿性蛋白酶和中性蛋白酶對蒸煮液酶解效果的影響。從圖1-a可知，當底物質量濃度一定時，酶添加量決定了酶與底物的反應速度[18]，隨著酶添加量的增加，TCA-NSI逐漸上升，但當酶添加量超過4 g/L時，TCA-NSI隨之下降。

圖1 不同因素對TCA-NSI的影響Fig.1 Effect of different factors on TCA-NSI

從圖1-b可知，隨著溫度的上升，TCA-NSI呈先上升后下降趨勢，這可能是由于隨著溫度的上升，酶活力不斷提高，水解速率加快，但溫度太高可能會造成酶結構破壞。從圖1-c可知，當底物質量濃度低于100 g/L時，TCA-NSI隨底物質量濃度增加而上升，但當底物質量濃度超過100 g/L時，可能由于總氮增加量遠大于多肽增加量[19]，導致TCA-NSI下降。從圖1-d可知，當酶解時間超過45 min時，水解過程基本可達穩定狀態。從圖1-e可知，隨著pH提高，酶解效果呈先上升后緩慢下降趨勢，這主要是由于酶反應需要最適pH，極端pH可能會使得蛋白酶變性，從而影響酶活力[20]。從圖1-f可知，隨著固定化中性蛋白酶比例的增加，TCA-NSI先上升后下降，當復合酶比例為1∶1時TCA-NSI達最大值。

2.2 酶解工藝響應面試驗

2.2.1 響應面實驗結果分析

利用Design-Expert 8.0.6將TCA-NSI值與各因素進行回歸擬合，得到TCA-NSI對溫度(A)、酶解pH(B)、復合酶比例(C)的最佳回歸方程為：Y=76.38-1.24A-2.23B+0.87C-1.61AB-0.12AC-2.11BC-8.55A2-3.09B2-6.07C2，R2=0.985 6。

通過顯著性檢驗和模型變異數分析，該模型能夠較好預測TCA-NSI值(表2)。

表2 回歸方程各項系數的顯著性檢驗和變異數分析Table 2 Significance test and analysis of variancecoefficients of regression equation

注：*顯著性差異，P<0.05；**極顯著性差異，P<0.01

等高線形狀反應各因素之間的交互是否顯著，若等高線呈橢圓形則表明各因素之間交互顯著，若呈圓形則表明各因素之間交互不顯著[21-22]。由圖2可知，這3組因素的交互作用強弱為：BC>AB>AC，這與表2顯著性檢驗結果相一致。各因素對酶解效果的影響順序為：pH>溫度>復合酶比例。

圖2 不同因素兩兩交互對TCA-NSI影響的響應面圖和等高線圖Fig.2 Response surface plots and contour plots of interactive effect of different factors on TCA-NSI

2.2.2 工藝條件確定及驗證性實驗

由Design-Expert軟件得到的優化工藝條件為：溫度54.14 ℃、pH 7.80、堿性蛋白酶與中性蛋白酶比例1.36∶1。為驗證模型的可信度，以及考慮實際操作的方便性，將驗證條件設計為：溫度54.10 ℃、pH為7.80、復合酶比例1.5∶1，重復驗證3次。結果顯示，響應面預測得到的TCA-NSI為76.91%，而驗證結果為77.27%，驗證結果與預測值相近，表明所得回歸模型能夠較好預測酶解過程。

2.3 酶解液蛋白肽氨基酸組成

由表3可知，在酶解液蛋白肽的氨基酸組成中，人體必需氨基酸組成豐富，EAAI值為0.99。

據報道，EAAI值>0.95、0.86～0.95、0.75～0.86、≤0.75分別表示蛋白品質優、良好、可用、不足[23]。因此，所制備的鳀魚蒸煮液蛋白肽具有較高的蛋白品質。此外，藥效氨基酸(包括谷氨酸[25]、甘氨酸[26]、精氨酸[27])的質量分數為16.68%，高于郭鵬柳等[24]報道的海參內臟酶解產物中藥效氨基酸的質量分數。綜上可知，該酶解液具有較好的氨基酸組成和蛋白品質。

表3 酶解液蛋白肽氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of enzymatic hydrolysate

注：*表示必需氨基酸

2.4 酶解液蛋白肽的分子質量分布

由表4可知，經固定化酶酶解后酶解液中由10～40個氨基酸組成的中長肽鏈(相對分子質量在1 500～5 000 Da)占8.163%，由2～10個氨基酸組成的小肽鏈(相對分子質量在180～1 500 Da)占82.518%，而游離氨基酸占8.723%，該結果與游離中性蛋白酶及堿性蛋白酶的酶解結果相近[27]。因此，固定化酶可將蒸煮液中的大分子質量蛋白質水解成小分子多肽。

表4 蒸煮液及酶解液蛋白肽的分子質量分布Table 4 Molecular weight distribution of enzymatichydrolysate and anchovy cooking liquid

2.5 酶解液蛋白肽抗氧化活性研究

圖3 不同質量濃度的蛋白肽和抗壞血酸對自由基清除率的影響Fig.3 Effects of different concentrations of hydrolyzed peptides and ascorbic acid on free radical scavenging rate

2.6 固定化酶重復利用性研究

磁性CLEAs通過外部磁場可與反應介質相分離，從而實現重復利用。由圖4可知，固定化酶重復利用2次時TCN-NSI值未顯著降低。當重復利用次數從2次增加至5次，TCA-NSI值從70.98%降低至35.09%，在重復利用5次時TCA-NSI值仍可保持首次使用時的48%。該結果表明，所制備的固定化酶具有較好的重復利用性。

圖4 重復利用固定化酶對TCA-NSI的影響Fig.4 Effect of reusing immobilized enzyme on TCA-NSI

3 結論

本研究利用磁性酶交聯聚集體技術制備固定化中性蛋白酶和堿性蛋白酶，優化了鳀魚蒸煮液的固定化酶解條件，并對酶解產物進行性能表征。結果表明,在最佳酶解工藝條件下鳀魚蒸煮液的多肽得率可達77.27%。酶解產物的EAAI值大于0.95，藥效氨基酸及小分子多肽的質量分數較高，且具有較強的抗氧化性，可用于開發活性肽產品。此外，所制備的固定化酶可實現重復利用，在重復利用5次后仍具有較高的多肽得率，因此有利于降低生產成本。本研究結果可為實現低值魚蒸煮液的高值化利用提供理論參考和實驗依據。