豆醬白點(diǎn)物質(zhì)組成及模擬發(fā)酵條件優(yōu)化

閔世豪，單萬祥，鈕成拓，趙佳迪，鄭飛云，劉春鳳，王金晶，李崎*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué)，釀酒科學(xué)與工程研究室，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

我國傳統(tǒng)釀造調(diào)味食品普遍采用多菌種參與的開放式固態(tài)發(fā)酵或半固態(tài)發(fā)酵工藝，發(fā)酵周期較長，參與的微生物種類繁多，微生物群落在發(fā)酵過程中不斷演替變化，從而完成大分子原料的降解、轉(zhuǎn)化、代謝等過程[1]。豆醬發(fā)酵過程中豆類原料(如黃豆、蠶豆)中的蛋白質(zhì)被微生物利用轉(zhuǎn)化為多肽、氨基酸及其他營養(yǎng)物質(zhì)，逐漸形成風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富[2]且具有較高生物活性的發(fā)酵豆類產(chǎn)品[3]。在豆醬發(fā)酵過程中，特別是在發(fā)酵的中后期及儲存期，會逐漸出現(xiàn)白色結(jié)晶狀物質(zhì)，被稱為白點(diǎn)。這種白點(diǎn)物質(zhì)在東、西方發(fā)酵食品中均被發(fā)現(xiàn)，在東方發(fā)酵食品中，主要出現(xiàn)在火腿[4]、泰式豆醬[5]、豆豉[6]、腐乳[7]和蠶豆醬[8]中，而在西方發(fā)酵食品中，主要出現(xiàn)在奶酪[9-11]中。

從20世紀(jì)初開始，研究者對豆醬中的白點(diǎn)物質(zhì)組成就有了研究，最初有人推測其是草酸鈣結(jié)晶[12]，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)白點(diǎn)物質(zhì)的主要成分是酪氨酸[4-11]。之前的研究[13]表明，在蠶豆醬中白點(diǎn)物質(zhì)是由米曲霉(Aspergillusoryzae)產(chǎn)生的大量蛋白酶非定向切割蛋白原料產(chǎn)生過量酪氨酸形成的，可以通過篩選蛋白水解酶活性低的米曲霉來進(jìn)行白點(diǎn)物質(zhì)的防治。KR?CKEL等[14]利用共聚焦拉曼顯微鏡定性分析證明，鹽焗牛肉腸中白點(diǎn)物質(zhì)主要成分是酪氨酸和苯丙氨酸，他認(rèn)為是牛肉內(nèi)自身的蛋白酶水解蛋白產(chǎn)生過量的酪氨酸，從而產(chǎn)生白點(diǎn)物質(zhì)。孫軍勇等[15]將有白點(diǎn)腐乳和無白點(diǎn)腐乳進(jìn)行對比,證明腐乳白點(diǎn)的產(chǎn)生跟大豆蛋白質(zhì)的過度水解有關(guān)。結(jié)合文獻(xiàn)推測白點(diǎn)形成是由于蛋白酶過度水解產(chǎn)生過量酪氨酸[13-16]，酪氨酸再進(jìn)一步結(jié)晶形成白點(diǎn)。雖然對于白點(diǎn)有著眾多研究，但是有針對性的解決方案卻不多，主要因?yàn)槔野彼崾堑鞍踪|(zhì)分解的產(chǎn)物，控制酪氨酸的生成就會導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解不徹底，從而影響發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味。

目前我國豆類發(fā)酵食品最常用的發(fā)酵菌株為米曲霉，其中米曲霉3.042具有豐富的酶系，產(chǎn)蛋白酶酶活力較高，是醬油、豆醬等發(fā)酵食品的主要生產(chǎn)菌株[17-18]。基于該菌株發(fā)酵生產(chǎn)豆醬的前期研究[19]，本研究對豆醬中的白點(diǎn)物質(zhì)進(jìn)行氨基酸分析。在此基礎(chǔ)上，以大豆分離蛋白(soy protein isolate, SPI)培養(yǎng)基模擬醬醅環(huán)境，并接種米曲霉3.042菌株進(jìn)行模擬發(fā)酵，測定其發(fā)酵液中酪氨酸濃度及蛋白質(zhì)分解程度，并通過改變發(fā)酵條件來控制酪氨酸的生成和蛋白質(zhì)的降解情況，從而獲得控制豆醬發(fā)酵過程中酪氨酸濃度的發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI、麩皮，市售；可溶性淀粉、甲醛、NaOH、三氯乙酸、甲醇(色譜級)，國藥試劑；無水乙酸鈉(色譜級)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酪氨酸(色譜級)，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氨基酸專用高效液相色譜儀、高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；分析天平，無錫凱派克斯科技有限公司；電子天平，梅特勒-托多儀器有限公司；BSP-250生化培養(yǎng)箱，上海博訊公司。

1.3 培養(yǎng)基與菌株

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，121 ℃滅菌15 min。

活化培養(yǎng)基：麩皮50 g，蒸餾水500 mL, 115 ℃滅菌15 min。

SPI培養(yǎng)基：SPI 5 g/L，可溶性淀粉1 g/L，115 ℃滅菌15 min。

Aspergillusoryzae3.042為我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品常用菌株，保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 白點(diǎn)物質(zhì)的提取及氨基酸測定

將產(chǎn)白點(diǎn)黃豆醬在25目標(biāo)準(zhǔn)篩上攤開，用鑷子將白點(diǎn)物質(zhì)取出，用無菌水沖洗后置于干凈的燒杯中,80 ℃烘干。

游離氨基酸及水解氨基酸的前處理步驟參照衛(wèi)陽飛等[20]方法，具體步驟如下：

游離氨基酸測定：取精確稱量1 g樣品，并用50 g/L 三氯乙酸溶解于25 mL容量瓶中。常溫超聲20 min，靜置2 h后，將上清液雙層濾紙過濾，取1 mL過濾液于1.5 mL離心管中,12 000 r/min離心10 min,用0.22 μm水膜再過濾1次，取400 μL過濾液于液相樣品瓶。

水解氨基酸測定：稱取100.0 mg充分干燥的白點(diǎn)物質(zhì)于水解管，加入8 mL 6 mol/L HCl。向水解管中充入氮?dú)饧s3 min，調(diào)節(jié)流速，使溶液呈微沸狀態(tài)，擰緊水解管蓋子.將水解管放入120 ℃烘箱中，水解22 h后，將水解管樣品全部轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，加入4.8 mL濃度為10 mol/L的NaOH溶液，定容，使用雙層濾紙過濾容量瓶中的溶液，取1 mL澄清濾液于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心10 min，取上清液約500 μL(可通過0.22 μm水膜再次過濾)于液相取樣瓶。

分析條件：氨基酸組成分析在Agilent 1100系列HPLC系統(tǒng)上進(jìn)行，注射體積為5 μL。色譜分離在C18柱(4.0 mm×125 mm)中進(jìn)行，流速為1 mL/min，溫度為40 ℃。洗脫系統(tǒng)為20 mmol/L乙酸鈉(A)和V(20 mmol/L乙酸鈉)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶2∶2混合溶液，監(jiān)測器波長為338 nm和263 nm。

1.4.2 菌株培養(yǎng)

用無菌水從PDA培養(yǎng)基斜面上收集米曲霉孢子，獲得濃度為107孢子/mL的孢子懸液。取5 mL孢子懸液接種于50 g的麩皮培養(yǎng)基中，于30 ℃下培養(yǎng)48 h。取200 mL無菌水加入活化完成的培養(yǎng)基中于30 ℃水浴、180 r/min條件下振蕩30 min；用8層紗布過濾得到活化后的孢子懸液，將此孢子懸液以1∶3(V∶V)的比例加入含80、100、120 g/L(鹽的質(zhì)量濃度)的SPI培養(yǎng)基中，于不同溫度(25、30、35、40 ℃)下培養(yǎng)70 h。

1.4.3 發(fā)酵液中酪氨酸的測定

取1 mL發(fā)酵液與1 mL 100 g/L三氯乙酸溶液混合，靜置1 h,12 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液，使用0.22 μm水膜再次過濾后置于液相瓶，采用HPLC進(jìn)行酪氨酸分析。

分析條件根據(jù)紀(jì)傳俠的方法[21]并進(jìn)行優(yōu)化，色譜分離在C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)中進(jìn)行，流動相為0.1 mol/L的醋酸鈉溶液，流速為1 mL/min，溫度為30 ℃，紫外檢測波長為280 nm。

1.4.4 發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮的測定

根據(jù)GB5009.235—2016中氨基酸態(tài)氮測定方法進(jìn)行調(diào)整。取5 mL上述發(fā)酵液于50 mL燒杯中，加入15 mL無菌水，用0.05 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH為8.2，加入2.5 mL甲醛，繼續(xù)滴定至pH為9.2。根據(jù)公式(1)計算氨基酸態(tài)氮的含量。

(1)

式中：X，試樣中氨基酸態(tài)氮的含量，g/100 g；V3，加入甲醛后消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；V4，試劑空白試驗(yàn)中加入甲醛后消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；V，試樣稀釋液的取用量，mL；c，NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定液的濃度，mol/L。

為表征發(fā)酵液中酪氨酸與蛋白分解程度之間的線性關(guān)系，定義k值，其計算公式如下：

(2)

k值越大表明酪氨酸在發(fā)酵液總氨基酸中占比越小，k值越小表明酪氨酸在發(fā)酵液總氨基酸中占比越大。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆醬中白點(diǎn)物質(zhì)的氨基酸分析

根據(jù)表1數(shù)據(jù)計算發(fā)現(xiàn)，豆醬來源白點(diǎn)物質(zhì)游離氨基酸所占比例為40.96%，其中酪氨酸和苯丙氨酸為主要的游離氨基酸，兩者占總游離氨基酸的比例分別為87.61%和1.74%。白點(diǎn)物質(zhì)中水解氨基酸占78.90%，其中酪氨酸和苯丙氨酸為主要的水解氨基酸，兩者占總水解氨基酸的比例分別為94.83%和2.33%。由此可見，白點(diǎn)物質(zhì)主要成分為酪氨酸和苯丙氨酸，以游離態(tài)或者短肽、蛋白的形式存在，其余21.10%的組分可能是一些豆皮、辣椒籽等雜質(zhì)。進(jìn)一步計算發(fā)現(xiàn)，短肽中酪氨酸和苯丙氨酸所占比例分別為94.89%和2.75%。上述結(jié)果說明白點(diǎn)物質(zhì)主要由游離酪氨酸、游離苯丙氨酸和富含酪氨酸和苯丙氨酸的短肽組成。前期研究證實(shí)，豆醬白點(diǎn)主要為游離酪氨酸和苯丙氨酸，而本文首次提出白點(diǎn)物質(zhì)除了游離酪氨酸和苯丙氨酸之外，還存在大量富含酪氨酸和苯丙氨酸的短肽。

表1 豆醬中白點(diǎn)物質(zhì)的游離氨基酸和水解氨基酸分析Table 1 Analysis of free amino acids and hydrolyzed aminoacids in white spots isolated from soybean paste

2.2 模擬發(fā)酵中酪氨酸的變化

在豆醬發(fā)酵過程中，蛋白質(zhì)降解程度是衡量豆類原料發(fā)酵程度的重要指標(biāo)，通常采用氨基酸態(tài)氮來表征，氨基酸態(tài)氮含量越高，豆醬的風(fēng)味和品質(zhì)越佳。然而，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)降解程度過高時，酪氨酸(酪氨酸在大豆中占比約為1.2%[22])會顯著累積，其含量會超過其溶解度(25℃，0.45 g/L)，最終形成白點(diǎn)。控制適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)降解程度有助于在保證豆醬品質(zhì)的同時減少白點(diǎn)物質(zhì)產(chǎn)生的幾率，因此，將模擬體系中鹽的最終質(zhì)量濃度分別調(diào)整為80、100、120 g/L，并分別在25、30、35和40 ℃條件下發(fā)酵，同時對模擬發(fā)酵體系發(fā)酵過程中的氨基酸態(tài)氮含量和酪氨酸含量進(jìn)行檢測。

2.2.1 發(fā)酵過程中酪氨酸含量及氨基酸態(tài)氮變化分析

對模擬體系發(fā)酵過程中的酪氨酸含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)酪氨酸的含量呈迅速增加到緩慢增加的變化趨勢，且在發(fā)酵50 h后趨于穩(wěn)定(圖1)。當(dāng)模擬發(fā)酵體系的鹽度發(fā)生變化時，酪氨酸含量并沒有明顯的變化；但是當(dāng)發(fā)酵溫度發(fā)生變化時，不同鹽度條件下的模擬體系中酪氨酸含量均隨溫度升高而逐漸提高。這可能是由于在活化培養(yǎng)基中米曲霉所產(chǎn)生的特異性或非特異性切割酪氨酸的蛋白酶的最適溫度為40 ℃，在該溫度下,酶活力高于25、30和35 ℃的酶活力，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解程度提高，酪氨酸含量顯著高于其他溫度。

a-80 g/L鹽度;b-100 g/L鹽度;c-120 g/L鹽度圖1 模擬醬醅發(fā)酵過程中酪氨酸質(zhì)量濃度的變化Fig.1 The change of tyrosine during the fermentation of simulated soy sauce mash

氨基酸態(tài)氮是判斷醬醅發(fā)酵是否合格的重要指標(biāo)之一，本研究用氨基酸態(tài)氮來表征發(fā)酵液中蛋白質(zhì)分解程度。由圖2所示，氨基酸態(tài)氮含量受鹽度影響較小，而受溫度影響較大。氨基酸態(tài)氮含量增長趨勢與酪氨酸含量變化趨勢相似，這同樣可能是因?yàn)榛罨浊顾a(chǎn)生的蛋白酶在發(fā)酵時期開始作用，其酶活力隨溫度增加而增大，研究發(fā)現(xiàn),在25～40 ℃米曲霉蛋白酶活力逐漸增加[23]，這也使得氨基酸態(tài)氮含量增加，也就是發(fā)酵液中蛋白分解程度增加。此前研究表明鹽度對于氨基酸態(tài)氮的影響也并不大，而溫度是影響氨基酸態(tài)氮及風(fēng)味物質(zhì)的主要原因[24]。綜上，溫度對于豆類發(fā)酵中蛋白分解程度存在著較大影響。

a-80 g/L鹽度;b-100 g/L鹽度;c-120 g/L鹽度圖2 模擬醬醅發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度的變化Fig.2 The change of amino acid nitrogen during the fermentation of simulated soy sauce mash

2.2.2 發(fā)酵過程中酪氨酸與氨基酸態(tài)氮相關(guān)性分析

根據(jù)上述研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)豆醬模擬發(fā)酵體系中酪氨酸的累積與蛋白分解程度的增長密切相關(guān)，但是兩者之間的關(guān)系尚未明確。將不同鹽度和不同溫度下模擬發(fā)酵液中酪氨酸含量及氨基酸態(tài)氮含量進(jìn)行線性擬合。從圖3及表2可以看出，鹽度對于k值幾乎沒有影響，而溫度對k值有重要影響。當(dāng)溫度為40 ℃時，3個鹽度下的k值顯著低于其他溫度下的k值，說明在相同蛋白分解度下40 ℃下發(fā)酵會產(chǎn)生更多的酪氨酸。在其他溫度下擬合得到曲線的k值差異較小。

a-80 g/L鹽度;b-100 g/L鹽度;c-120 g/L鹽度圖3 模擬醬醅發(fā)酵過程中酪氨酸與氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis of tyrosine and amino acid nitrogen

表2 模擬醬醅發(fā)酵過程中酪氨酸與氨基酸態(tài)氮線性擬合方程Table 2 Linear fitting equation of tyrosine and aminoacid nitrogen in simulated soy sauce fermentation

根據(jù)表3所示，對比不同發(fā)酵條件下擬合曲線得到的k值，發(fā)現(xiàn)在30 ℃、100 g/L鹽度的條件下，k值較大，這說明在同一蛋白分解程度下，酪氨酸含量相對較少。因此，在此條件下進(jìn)行豆醬發(fā)酵，即能保證氨基酸風(fēng)味又能對酪氨酸含量進(jìn)行有效的控制。

3 結(jié)論

豆醬是我國傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品之一，而其白點(diǎn)問題由來已久，以前的大部分研究都認(rèn)為白點(diǎn)物質(zhì)是由酪氨酸形成的，本研究認(rèn)為，它的主要成分并不是完全由游離酪氨酸組成，而是由游離酪氨酸和富含酪氨酸的短肽形成的。與此同時，通過改變模擬發(fā)酵條件，發(fā)現(xiàn)溫度是影響酪氨酸含量及蛋白分解程度最主要的因素，在30 ℃、100 g/L鹽度下進(jìn)行發(fā)酵，可以在保證較高蛋白質(zhì)分解程度的前提下盡量減少發(fā)酵產(chǎn)品中酪氨酸的含量。本研究對豆醬行業(yè)白點(diǎn)問題的控制及解決具有一定的指導(dǎo)意義。